Δελτίο Τύπου για την Παγκόσμια Ημέρα κατά της Φυματίωσης 2019

ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΗΜΕΡΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ, 24 ΜΑΡΤΙΟΥ 2019

Η παγκόσμια ημέρα φυματίωσης, είναι ημέρα ενημέρωσης του κοινού για την παγκόσμια επιδημία της φυματίωσης αλλά και ημέρα ευαισθητοποίησης γύρω από τις προκλήσεις που αντιμετωπίζουμε και τα προβλήματα που μας εμποδίζουν να εξαλείψουμε αυτή την καταστροφική νόσο. Φέτος το μήνυμα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) είναι «Ήρθε η ώρα!»

Ήρθε η ώρα για ενεργητική αναζήτηση και θεραπεία της ενεργού και λανθάνουσας φυματίωσης

Πρέπει να εντατικοποιηθεί ο έλεγχος για φυματίωση των ευάλωτων ομάδων πληθυσμού και ιδιαίτερα των προσφύγων και μεταναστών, των φυλακισμένων, των τροφίμων ψυχιατρικών ιδρυμάτων και ιδρυμάτων χρονίως πασχόντων.

Ήρθε η ώρα για καλύτερη εκπαίδευση, αλλά και ενίσχυση της υποψίας και ευαισθητοποίησης για τη διάγνωση της φυματίωσης.

Ήρθε η ώρα για την αξιόπιστη καταγραφή της επίπτωσης  του νοσήματος στη χώρα μας, μέσω σύνδεσης της ηλεκτρονικής συνταγογράφησης αντιφυματικών φαρμάκων με τη δήλωση των περιστατικών φυματίωσης.

Μόνο όταν γνωρίζεις πραγματικά τον «εχθρό» μπορείς να τον νικήσεις.

Ήρθε η ώρα  για στελέχωση και λειτουργία αντιφυματικών ιατρείων και κατάλληλες συνθήκες νοσηλείας σε όλα τα περιφερειακά νοσοκομεία, ιδιαίτερα στα ακριτικά νησιά.

Ήρθε η ώρα για άμεση πρόσβαση στη θεραπεία και αδιάλειπτη διαθεσιμότητα όλων των αντιφυματικών φαρμάκων, σύμφωνα με τις οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας.

Ήρθε η ώρα για ανάπτυξη εθνικής στρατηγικής  για την φυματίωση.

Ήρθε η ώρα όλα τα παραπάνω να γίνουν πράξη. 

Το μήνυμα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας

Κάθε χρόνο, στις 24 Μαρτίου, γιορτάζουμε την Παγκόσμια Ημέρα Φυματίωσης, για να ευαισθητοποιήσουμε το κοινό όσον αφορά τις καταστροφικές κοινωνικές και οικονομικές συνέπειες της φυματίωσης και να εντείνουμε τις προσπάθειές μας για τον τερματισμό της παγκόσμιας επιδημίας της φυματίωσης. Η ημερομηνία αυτή σηματοδοτεί την ημέρα όπου, το 1882, ο Δρ. Robert Koch ανακοίνωσε ότι είχε ανακαλύψει το βακτήριο που προκαλεί τη φυματίωση. Η ανακάλυψη αυτή  άνοιξε το δρόμο για τη διάγνωση και τη θεραπεία της ασθένειας.

Η φυματίωση παραμένει το συχνότερο αίτιο θανάτου από λοιμώδες νόσημα στον κόσμο. Κάθε μέρα, σχεδόν 4.500 άνθρωποι χάνουν τη ζωή τους από φυματίωση και περίπου 30.000 άνθρωποι αρρωσταίνουν από αυτή την ασθένεια, που μπορεί και να προληφθεί αλλά και να θεραπευθεί. Από το 2000 μέχρι σήμερα, συνολικά 54 εκατομμύρια ζωές έχουν σωθεί χάρις στις παγκόσμιες προσπάθειες για την καταπολέμηση της φυματίωσης και η θνητότητα της νόσου έχει μειωθεί κατά 42%.

Προκειμένου να εντατικοποιηθεί ο αγώνας κατά της φυματίωσης και να επιτευχθούν οι στόχοι που έχει θέσει η παγκόσμια κοινότητα για την καταπολέμηση του νοσήματος, οι αρχηγοί των κρατών συναντήθηκαν τον Σεπτέμβριο του 2018 και ανέλαβαν ισχυρές δεσμεύσεις για την εξάλειψη της φυματίωσης, στη διάρκεια της πρώτης υψηλού επιπέδου συνάντησης του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ).

Το θέμα της Παγκόσμιας Ημέρας TB 2019 - «Ήρθε η ώρα» - δίνει έμφαση στην επείγουσα ανάγκη που υπάρχει να δράσουμε, βασισμένοι στις δεσμεύσεις των παγκόσμιων ηγετών, ώστε:

• να κλιμακωθεί η πρόσβαση στην πρόληψη και τη θεραπεία
• να υπάρξει ανάληψη ευθυνών
• να εξασφαλισθεί επαρκής και βιώσιμη χρηματοδότηση και για την έρευνα
• να προωθηθεί ο τερματισμός του στιγματισμού και των διακρίσεων
• να προωθηθεί μια δίκαιη απάντηση στο πρόβλημα της φυματίωσης,  βασισμένη στα ανθρώπινα δικαιώματα, με επίκεντρο τον άνθρωπο

Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ),σε συνεργασία με το Παγκόσμιο Ταμείο και τη Σύμπραξη “Stop TB”, ξεκίνησε τη συλλογική πρωτοβουλία "Βρείτε. Θεραπεύστε. Όλους. #Εξαλείψτε τη φυματίωση”, με στόχο την επιτάχυνση της απάντησης στη φυματίωση και την εξασφάλιση πρόσβασης στην περίθαλψη, σε συμφωνία με τη συνολική προσπάθεια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για την Καθολική Κάλυψη Υγείας.

Αυτή την Παγκόσμια Ημέρα Φυματίωσης, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας καλεί τις κυβερνήσεις, τις πληγείσες κοινότητες, τις οργανώσεις της κοινωνίας των πολιτών, τους παρόχους υγειονομικής περίθαλψης και τους εθνικούς και διεθνείς εταίρους να ενώσουν τις δυνάμεις τους κάτω από το σύνθημα "Βρείτε. Θεραπεύστε. Όλους. #Εξαλείψτε τη φυματίωση”,  για να εξασφαλισθεί ότι κανείς δεν μένει πίσω. Ήρθε η ώρα για δράση!

Ήρθε η ώρα να εξαλείψουμε την φυματίωση.

Το Δελτίο Τύπου μπορείτε να το διαβάσετε και από εδώ

WHO: WORLD TB DAY 2019

ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΗΜΕΡΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ 2019

Για να "ανοίξετε" την παρουσίαση πατήστε εδώ.

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΔΟΚΙΜΑΣΙΩΝ quantiferon tb gold ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ

N.Helmy^aS.Abdel latif^bM.M.Kamel^aW.Ashour^aE.El Kattan^a

Η απόκριση του ανοσοποιητικού στη φυματίωση (TB) διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στην έκβαση της λοίμωξης από το Mycrobacterium tuberculosis. Είναι σαφές ότι το ανοσοποιητικό σύστημα αντιδρά αποτελεσματικά στη πλειοψηφία των λοιμώξεων. Αυτό είναι ιδιαίτερα εμφανές στην περίπτωση της φυματίωσης, όπου οι περισσότεροι άνθρωποι που έχουν μολυνθεί από τον βάκιλο της φυματίωσης δεν αναπτύσσουν την ασθένεια ποτέ στη διάρκεια της ζωής τους. Όμως, παρόλο που η ανοσία η μεσολαβούμενη από τα κύτταρα των ξενιστών είναι αρκετή ώστε να ελέγξει την εξέλιξη της νόσου, πολλές φορές αποτυγχάνει να επιτύχει απόλυτη εκρίζωση και ως εκ τούτου, δυο δισεκατομμύρια μολυσμένα άτομα υποφέρουν από την λανθάνουσα μορφή της φυματίωσης (LTBI).

Όπως και σε άλλες ενδοκυττάριες λοιμώξεις, η πρωταρχική προστατευτική απόκριση του ανοσοποιητικού είναι η κυτταροδιαμεσολαβούμενη και όχι η μεσολαβούμενη από αντισώματα ανοσία. Το M. tuberculosis βρίσκεται εντός του μακροφάγου και είναι σχετικά ανθεκτικό σε μικροβιοκτόνους μηχανισμούς που καταπολεμούν αποτελεσματικά άλλα φαγοκυτταρωμένα βακτηρίδια. Σε αυτό οφείλεται εν μέρει η ικανότητα των βακίλων της φυματίωσης να αποφεύγουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων που συμβαίνει από την IFN-γ και IL-12. Επιπρόσθετα, οι ανεπάρκειες της IL-12 ή της IFN-γ, ή των υποδοχέων τους, καθιστούν το άτομο ακόμη πιο ευαίσθητο στις μυκοβακτηριδιακές λοιμώξεις.

Έχουν γίνει προσπάθειες να αξιοποιηθεί η απόκριση των Τ-κυττάρων για ταχεία διάγνωση της λοίμωξης από Μ. Tuberculosis, μέσω των προσδιορισμών ιντερφερόνης (ΙFΝ) -γ. Αυτές οι δοκιμασίες βασίζονται στο γεγονός ότι Τ-κύτταρα ήδη ευαισθητοποιημένα με φυματικά αντιγόνα θα παράγουν ΙFΝ-γ όταν εκτίθενται εκ νέου σε μυκοβακτηριδιακά αντιγόνα. Επομένως μια υψηλή παραγωγή IFN-γ υποτίθεται ότι συσχετίζεται με τη λοίμωξη από την ΤΒ.

Η εξέταση QuantiFERON®-TB Gold (QFT-G) είναι μια εξέταση ολικού αίματος για χρήση ως βοήθεια στη διάγνωση της λοίμωξης από M. tuberculosis, συμπεριλαμβανομένης της λανθάνουσας φυματιώδους λοίμωξης (LTBI) και της ενεργού φυματίωσης (TB). Η  εξέταση αυτή εγκρίθηκε από την FDA το 2005.

Οι πρώτες δοκιμασίες ΙFΝ έκαναν χρήση κεκαθαρμένου παραγώγου πρωτεΐνης (PPD) ως διεγερτικού αντιγόνου. Πιο πρόσφατες δοκιμασίες, χρησιμοποιούν αντιγόνα που είναι ειδικά για το Μ. tuberculosis, όπως το ESAT6 και το CFP10, πρωτεϊνικά αντιγόνα που κωδικοποιούνται από γονίδια που βρίσκονται στο γονιδίωμα του M. tuberculosis και είναι πολύ πιο ειδικά από το PPD, επειδή δεν είναι κοινά με το Mycrobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) ή τα περισσότερα μη φυματιώδη μυκοβακτηρίδια (NTM) με εξαίρεση τα Mycrobacterium marinum, Mycrobacterium sulzgai και Mycrobacterium kansassi . Έτσι, αυτές οι εξετάσεις παρέχουν μια εναλλακτική λύση που πλεονεκτεί έναντι της δερματικής δοκιμασίας φυματίνης με τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα της, ειδικά σε εμβολιασμένα με BCG άτομα και σε περιοχές με υψηλή συχνότητα (δεν διακρίνει την ενεργό νόσο από τη λανθάνουσα).

Η QFT-G προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με την TST, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης ειδικότητας όσον αφορά άτομα που έχουν εμβολιαστεί με BCG και την εξάλειψη της ανάγκης για δεύτερη επίσκεψη για να διαβαστεί η TST. Αυτοί που παρέχουν έλεγχο της φυματίωσης θα πρέπει να καθορίσουν εάν η QFT-G θα αντικαταστήσει την TST ή θα χρησιμοποιηθεί για την επιβεβαίωση των θετικών αποτελεσμάτων TST. Οι εκτιμήσεις θα περιλαμβάνουν το κόστος, τη σκοπιμότητα, τους ρυθμούς μέτρησης TST και τη διαθεσιμότητα της εξέτασης. Το μέγιστο όφελος από την QFT-G είναι πιθανό να παρουσιάζεται:

1) σε άτομα που έχουν εμβολιαστεί με BCG

2) σε πληθυσμούς με ανεπαρκή ρυθμό τήρησης της ανάγνωσης του TST

3) και σε χώρους όπου η εξασφάλιση της ποιότητας και η κατάρτιση που αφορά τις δερματικές δοκιμασίες φυματίνης είναι ανεπαρκής ή ελλιπής

Η QFT-G, όπως και η TST, δεν μπορούν να διαφοροποιήσουν την ενεργό λοίμωξη της φυματίωσης από τη λανθάνουσα.

Η διάγνωση της LTBI απαιτεί να αποκλειστεί η ενεργός νόσος της φυματίωσης με κλινικοεργαστηριακή ιατρική αξιολόγηση, η οποία θα πρέπει να περιλαμβάνει:

1) τον έλεγχο συμπτωμάτων και σημείων

2) την ακτινογραφία θώρακος

3) και, όταν ενδείκνυται, την εξέταση των πτυέλων ή άλλων κλινικών δειγμάτων για την παρουσία του M. tuberculosis

Όπως και με το αρνητικό αποτέλεσμα της TST, τα αρνητικά αποτελέσματα μιας QFT-G δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μεμονωμένα για να αποκλείσουν τη λοίμωξη από M. tuberculosis σε άτομα με συμπτώματα ή σημεία που υποδηλώνουν ενεργό ή λανθάνουσα νόσο ΤΒ. Η παρουσία συμπτωμάτων ή σημείων που υποδηλώνουν νόσο ΤΒ αυξάνει την πιθανότητα ύπαρξης λοίμωξης από M. tuberculosis και οι συνθήκες αυτές μειώνουν την προγνωστική αξία ενός αρνητικού αποτελέσματος QFT-G ή TST. Η ιατρική αξιολόγηση αυτών των ατόμων θα πρέπει να περιλαμβάνει:

- ιστορικό και φυσική εξέταση

- ακτινογραφία θώρακος

- βακτηριολογικές μελέτες με επίχρισμα και καλλιέργεια

- ορολογικό έλεγχο για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV)

- και, όταν ενδείκνυται, άλλες δοκιμές ή μελέτες (πχ μοριακές τεχνικές κ.α.)

Οι IGRAs είναι δυναμικές δοκιμασίες και συμβαίνουν μετατροπές και αναστροφές όταν ολοκληρωθεί η σειρά των εξετάσεων. Αυτό έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει μέσω των επαφών των ανθρώπων καθώς και με τους εργαζόμενους στον τομέα της υγείας. Δεν υπάρχει ομοφωνία ως προς το ποιος είναι ο καλύτερος ορισμός για τη μετατροπή. Οι αναστροφές στην QFT ορίστηκαν ως IFN-γ ⩾ 0.35 από την αρχική τιμή της μέτρησης και τιμή IFN-γ < 0.35 IU/ml  κατά την περίοδο παρακολούθησης μετά τη θεραπεία.

α) Ορισμένες αναστροφές μπορεί να αντανακλούν την εκρίζωση της λοίμωξης από την ΤΒ (αυτόματη ή λόγω θεραπείας)

β) Ορισμένες αναστροφές μπορεί να οφείλονται απλώς σε βιολογικές παραλλαγές μεταξύ των θετικών στις IGRA ατόμων

γ) Και ορισμένες αναστροφές μπορεί να οφείλονται σε μεταβλητότητα στις εργαστηριακές και στις εξεταστικές μεθόδους και παραμέτρους

δ) Άλλες μελέτες πρότειναν ότι οι αποκρίσεις IGRA είναι έμφυτα παροδικές και γενικά απαιτούν συνεχή έκθεση σε αντιγόνα της φυματίωσης για τη διατήρηση υψηλών ποσοτικών επιπέδων. Υποστηρίζουν ότι οι αναστροφές μπορεί απλώς να αντικατοπτρίζουν τον κύκλο ζωής του Μ. Tuberculosis, όπου το μυκοβακτηρίδιο εισέρχεται σε αδρανή κατάσταση (λανθάνουσα) στην οποία δεν μπορεί να εκκρίνει αξιόπιστα αντιγόνα όπως το ESAT-6 και το CFP- 10, αλλά εκκρίνει άλλα αντιγόνα (τα οποία δεν χρησιμοποιούνται στις διαθέσιμες IGRAs) οπότε η εξέταση είναι αρνητική. Εναλλακτική άποψη είναι ότι, το ESAT-6 και το CFP-10 μπορεί να εκκρίνονται με διαλείπουσα συχνότητα  κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής του Μ. Tuberculosis, γεγονός που μπορεί εν μέρει να εξηγήσει τις διακυμάνσεις με την πάροδο του χρόνου (λανθάνουσα ή ενεργός με ποικίλο αποτέλεσμα εξέτασης). Αυτές οι υποθέσεις αξίζουν περαιτέρω μελέτη.

Η μελέτη αυτή σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει το ρόλο των εξετάσεων Quantiferon TB gold ως μία από τις δοκιμασίες απελευθέρωσης ιντερφερόνης-γ (IGRAs) για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας κατά της φυματίωσης σε ασθενείς με ενεργό φυματίωση.

Τριάντα ασθενείς με ενεργό πνευμονική φυματίωση συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη από τον Αύγουστο του 2009 έως τον Φεβρουάριο του 2010 και η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο νοσοκομείο OMRANYA Chest,  όπου οι ασθενείς με ενεργό φυματίωση προσέρχονταν στα εξωτερικά ιατρεία του.

Οι συμμετέχοντες αποτελούνταν από 18 άνδρες και 12 γυναίκες. Οι ηλικίες τους κυμαίνονταν μεταξύ 17 και 87 ετών (μέσος όρος ± SD = 38 ± 20,2)

Υπήρξαν ασθενείς που εξαιρέθηκαν.

Όλοι υποβλήθηκαν σε:
1-Λήψη ιστορικού που περιλάμβανε ερωτηματολόγιο
2-Κλινική εξέταση
3-Εργαστηριακές εξετάσεις
4-Ακτινογραφία θώρακος

5-Μικροβιολογικές εξετάσεις:

- Εξέταση άμεσου επιχρίσματος για οξεάντοχο με χρώση Ziehl-Neelsen:

Κατά την πρώτη επίσκεψη: κατά την εξέταση

2η επίσκεψη: 2 μήνες αργότερα

3η επίσκεψη: 6 μήνες αργότερα

- Ενοφθαλμισμό σε μέσο καλλιέργειας για απομόνωση του Mycobacterium tuberculosis (μέσο Lowenstein-Jensen)

Όλοι οι ασθενείς στην ομάδα μελέτης υποβλήθηκαν σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας μέσο Lowenstein-Jensen (L-J) τη στιγμή της εξέτασης.

- Η εξέταση IFN-γ ολικού αίματος, το QuantiFERON®-TB Gold

Όλοι οι ασθενείς στην ομάδα μελέτης υποβλήθηκαν σε εκτίμηση του QuantiFERON-TB Gold:

Κατά την πρώτη επίσκεψη: κατά την εξέταση

2η επίσκεψη: 2 μήνες αργότερα.

3η επίσκεψη: 6 μήνες αργότερα.

Το Quantiferon-TB Gold In-Tube (ΙΤ) είναι ένα in vitro διαγνωστικό τεστ που χρησιμοποιεί πεπτιδικό κοκτέιλ που προσομοιώνει τις πρωτεΐνες ESAT-6, CFP-10 και TB7.7 για να διεγείρει λεμφοκύτταρα σε ηπαρινισμένο ολικό αίμα. Έτσι εκκρίνεται ιντερφερόνη-γ και η ανίχνευση της με μέθοδο ELISA χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση in vitro αποκρίσεων στα πεπτιδικά αντιγόνα που σχετίζονται με τη λοίμωξη με M. tuberculosis (που υπάρχουν στο τοίχωμα των σωληναρίων). Η ανίχνευση και η επακόλουθη ποσοτικοποίηση της ΙFΝ-γ αποτελεί τη βάση αυτής της δοκιμής σε άτομα που έχουν μολυνθεί από μικροοργανισμούς του συμπλέγματος του M. tuberculosis.

Η μελέτη μας δείχνει ότι οι αλλαγές στις αποκρίσεις της IFN-γ με τη θεραπεία είναι εξαιρετικά σημαντικές. Τα αποτελέσματα της εξέτασης QFT- G IT συσχετίζονται με τα αποτελέσματα του μικροβιολογικού επιχρίσματος πτυέλων για οξεάντοχα, της καλλιέργειας και του κλινικού αποτελέσματος. Η προοδευτική μείωση της απόκρισης (IFN) -γ που μετράται με τη δοκιμασία QFT G IT αντικατοπτρίζει τη μείωση του μυκοβακτηριδιακού φορτίου μετά από επιτυχή αντιφυματιώδη θεραπεία.

Η παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας κατά της φυματίωσης είναι ζωτικής σημασίας για τον καλύτερο έλεγχο της εξάπλωσης της λοίμωξης από MTB. Οι IGRAs είναι νέες έμμεσες αιματολογικές εξετάσεις για λοιμώξεις από Μ. Tuberculosis και ένας πολλά υποσχόμενο δείκτης μυκοβακτηριδιακού φορτίου και δραστικότητας της νόσου.

Κατά την πρώτη επίσκεψη κάποια άτομα σε αυτή τη μελέτη έδειξαν αρνητική καλλιέργεια, γεγονός που μπορεί να οφείλεται είτε σε έντονη απολύμανση του δείγματος είτε στα MOTT (μυκοβακτηρίδια εκτός της φυματίωσης). Κλινικά, στους περισσότερους ασθενείς με ΜΟΤΤ λοιμώξεις αρχικά υπάρχει υποψία ότι έχουν M. tuberculosis και αντιμετωπίζονται ως τέτοιοι. Στη μελέτη αυτή δεν επιβεβαιώσαμε την παρουσία ΜΟΤΤ στις καλλιέργειες των ασθενών μας με θετικό επίχρισμα πτυέλων.

Κάποια άτομα έδειξαν θετικό τεστ QuantiFERON και άλλα άτομα έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα. Εξηγήθηκε γιατί το αρνητικό αποτέλεσμα του QuantiFERON®-TB Gold IT δεν αποκλείει την πιθανότητα λοίμωξης από M. tuberculosis ή ενεργού νόσου της φυματίωσης λέγοντας ότι τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα θα μπορούσαν να οφείλονται στο στάδιο της μόλυνσης (π.χ. δείγμα που ελήφθη πριν από την ανάπτυξη της κυτταρικής ανοσολογικής αντίδρασης), συν-νοσηρές καταστάσεις που επηρεάζουν τις ανοσολογικές λειτουργίες, εσφαλμένο χειρισμό των σωληναρίων συλλογής αίματος μετά την αιμοληψία, μη ορθή διεξαγωγή της δοκιμής ή άλλες ανοσολογικές μεταβλητές.

Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης μη μετατροπή θετικών επιχρισμάτων πτυέλων σε τρία άτομα στο τέλος των δύο μηνών θεραπείας. Αυτό μελετήθηκε και διαπιστώθηκε ότι σχετίζεται σημαντικά με ηλικία μεγαλύτερη ή ίση των 40 ετών και την παρουσία πολυάριθμων βακίλων (3+) στα επιχρίσματα πτυέλων πριν από τη θεραπεία. Οι ασθενείς με αυτούς τους παράγοντες στους οποίους δεν υπάρχει μετατροπή μετά από δύο μήνες θεραπείας πρέπει να λαμβάνουν πλήρως εποπτευόμενη θεραπεία σε όλη τη διάρκειά της έτσι ώστε να αποφεύγεται ειδικότερα η μη τήρηση της θεραπείας.

Επίσης ένας ασθενής παρουσίασε επίμονο θετικό αποτέλεσμα της Quantiferon παρά τη μετατροπή του πτυέλου από θετικό σε αρνητικό.

Οι μελετητές απέδωσαν τους λόγους για τους οποίους οι ανοσολογικές αποκρίσεις ακόμη και σε ειδικά αντιγόνα (ESAT-6 και CFP-10) μπορεί να μην έχουν πέσει κάτω από το προκαθορισμένο επίπεδο της θετικότητας της εξέτασης μετά από θεραπεία κατά της φυματίωσης σε έκθεση σε περιβαλλοντικά μυκοβακτηρίδια που συνήθως συναντώνται σε τροπικές περιοχές, μερικά από τις οποίες μοιράζονται τα γονίδια ESAT-6 και CFP-10. Προτάθηκε επίσης ότι μπορεί να υπάρχει παραλλαγή μεταξύ των ατόμων στη δύναμη της απόκρισης της IFN-γ που μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από γενετικούς πολυμορφισμούς στον ξενιστή.

Όταν αξιολογήσαμε την ευαισθησία και την ειδικότητα των ασθενών κατά τη διάρκεια της θεραπείας στη δεύτερη επίσκεψη, η ειδικότητα της QFN-G-IT ήταν 95% και η ευαισθησία ήταν 100%.

Συγκρίναμε τη σχέση μεταξύ των αποτελεσμάτων της Quantiferon και της Z-N στην τρίτη επίσκεψη, και βρέθηκε μια στατιστικά σημαντική σχέση μεταξύ Quantiferon και Z-N. Τρεις περιπτώσεις με θετική Z-N έδειξαν θετική Quantiferon. Είκοσι περιπτώσεις με αρνητική Z-N εμφάνισαν αρνητική Quantiferon. Επισημάνθηκαν δύο περιπτώσεις:

α) Ένας από αυτούς τους ασθενείς έδειξε θετικό Quantiferon με αρνητικό αποτέλεσμα AFB και θεωρήθηκε ως ψευδώς θετικό αποτέλεσμα της δοκιμασίας QuantiFERon.

β) Η άλλη περίπτωση, έδειξε θετική Z-N και αρνητική Quantiferon τονίζοντας το γεγονός ότι δεν είναι όλα τα θετικά επιχρίσματα Z-N απαραίτητα και M. tuberculosis αλλά θα μπορούσε επίσης να είναι MOTT τονίζοντας ξανά το ρόλο των καλλιεργειών για την ακριβή διάγνωση της πνευμονικής φυματίωσης και της διαφοροποίησης μιας τυπικής λοίμωξης ΤΒ από μια άτυπη φυματιώδη λοίμωξη.

Συζητήθηκε η αλλαγή με την πάροδο του χρόνου στα αποτελέσματα του Quantiferon κατά τις τρεις επισκέψεις. Υπήρξε στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των θετικών περιπτώσεων κατά τη δεύτερη επίσκεψη όπως και κατά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων της πρώτης επίσκεψης με την τρίτη επίσκεψη μετά από 6 μήνες (τέλος της περιόδου μελέτης) δηλαδή υπήρξε σημαντική μείωση του αριθμού των θετικών περιπτώσεων QFT-G από 24 θετικούς από τους 29 ασθενείς στην πρώτη επίσκεψη έως 4 θετικούς στους 25 ασθενείς στην τρίτη αντίστοιχα. Οι 21 στους 25 ασθενείς (84%) που έγιναν αρνητικοί στο QFT-G στο τέλος της μελέτης είχαν πλήρη κλινική και μικροβιολογική αποκατάσταση της νόσου της φυματίωσης.

Σύμφωνα με κάποιους ερευνητές οι αποκρίσεις των Τ κυττάρων γενικά, ιδιαίτερα οι ασθενώς θετικές αποκρίσεις τους, τείνουν να παρουσιάζουν διακυμάνσεις με την πάροδο του χρόνου, ακόμη και απουσία ειδικής θεραπείας. Άλλοι επίσης έδειξαν ότι μια in vitro ανοσοδιαγνωστική δοκιμασία που βασίζεται στην απόκριση στα ESAT-6 πεπτίδια μπορεί να ανιχνεύσει μια άνοδο σε ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία. Μία πιθανή εξήγηση είναι ότι η έκκριση ειδικών πρωτεϊνών από το Μ. Tuberculosis, όπως η ESAT-6, απαιτεί μεταβολικά δραστικούς και ζώντες βακίλους και έτσι τα Τ κύτταρα που παράγουν IFN-γ ειδική για επιλεγμένα πεπτίδια ESAT-6 είναι παρόντα σε υψηλή συχνότητα κατά τη διάρκεια την ενεργούς φάσης της αναπαραγωγής των βακτηρίων. Έχει δειχθεί ότι αυτά τα Τ κύτταρα παραμένουν προενεργοποιημένα ίη νίνο και ικανά για γρήγορη δραστική λειτουργία στη συνέχεια. Ωστόσο, μετά την λήψη αποτελεσματικής θεραπείας, το Μ. Tuberculosis σταματά να αντιγράφεται ενεργά και η συχνότητα των Τ κυττάρων που είναι ειδικά για αυτά τα πεπτίδια μειώνεται δραματικά και συνεπώς δεν ανιχνεύεται με αυτόν τον in vitro ανοσοδιαγνωστικό προσδιορισμό (θεραπευθείσα ΤΒ με αρνητικό προσδιορισμό). Ωστόσο, η απόκριση μνήμης στην πρωτεΐνη ESAT-6 παραμένει (θεραπευθείσα ΤΒ με θετικό in vitro ανοσοδιαγνωστικό προσδιορισμό) .

Έχει προταθεί από ορισμένους μελετητές ότι η σύντομη περίοδος επώασης (16-24 ώρες), που χρησιμοποιείται συνήθως στις IGRAs, ανιχνεύει αποκρίσεις ενεργοποιημένων τελεστικών Τ κυττάρων που απελευθερώνουν ταχέως IFN-γ όταν διεγείρονται in vitro με αντιγόνο. Άλλοι επίσης επιβεβαιώνουν ότι τα μακροχρόνια ζώντα Τ κύτταρα κεντρικής μνήμης που μπορεί να είναι λιγότερο πιθανό να απελευθερώσουν ΙFΝ-γ κατά τη διάρκεια της βραχείας περιόδου έκθεσης στο αντιγόνο κατά την δοκιμασία IGRA, θα μπορούσαν να ανιχνευθούν μετά από μεγαλύτερη περίοδο διέγερσης in vitro. Δεδομένου ότι η απόκριση του τελεστικού Τ κυττάρου καθοδηγείται από το φορτίο του αντιγόνου, θεωρήθηκε από κάποιους μελετητές ότι η παρουσία ενεργούς αντιγραφής μυκοβακτηριδίων (ενεργός μη υποβληθείσα σε θεραπεία TB) σχετίζεται και με την παράλληλη αύξηση του αριθμού των τελεστικών Τ κυττάρων. Στο πλαίσιο ενός χαμηλού αντιγονικού φορτίου, όπως σε ασθενείς με επιτυχή αγωγή, ο αριθμός των τελεστικών Τ κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο Μ. Tuberculosis θα μπορούσε να πέσει κάτω από το επίπεδο θετικοποίησης (cut-off level) (θεραπευθείσα με αρνητικό προσδιορισμό).

Η μέση ευαισθησία της δοκιμασίας QFT-TB στη μελέτη μας ήταν 85,9% ενώ η μέση ειδικότητα ήταν 62,6%. Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν εξαιρετικό βαθμό ευαισθησίας και ειδικότητας της εξέτασης QFT-TB για διάγνωση της ενεργού ΤΒ. Άλλοι κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η δοκιμή QFT-TB είχε μέση ευαισθησία 86% και μέση ειδικότητα 94%. Έδειξαν ότι τα αποτελέσματα των δοκιμασιών Quantiferon που αφορούν ασθενείς με ενεργό φυματίωση, μειώθηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας με αντιφυματικά φάρμακα. Ο ρυθμός των θετικών αποτελεσμάτων των δοκιμασιών QFT-TB ήταν 86% κατά την έναρξη της θεραπείας, 48% έξι μήνες αργότερα και 33% 12 μήνες αργότερα. Άλλοι επίσης ανέφεραν 81% ευαισθησία μεταξύ 54 ασθενών, και άλλοι πάλι ανέφεραν 89% ευαισθησία μεταξύ 118 ασθενών.

Συμπερασματικά η ανάλυση των αποτελεσμάτων της δοκιμασίας QFT-G έδειξε ότι στην πλειονότητα των ασθενών με φυματίωση στην μελέτη αυτή υπήρξε συσχέτιση μεταξύ της έκβασης της θεραπείας και των αλλαγών της απόκρισης με IFN-γ σε ειδικά αντιγόνα του Μ. tuberculosis. Πράγματι, για όλους τους ασθενείς που είχαν πλήρη λύση της κλινικής νόσου και των οποίων τα μικροβιολογικά αποτελέσματα ήταν αρνητικά για το M. tuberculosis μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας των 6 μηνών, παρατηρήθηκε προοδευτική μείωση της απελευθέρωσης ΙFΝ-γ και το θετικό αποτέλεσμα της αρχικής μέτρησης της QFT-G έγινε αρνητικό.

References

[1]

Palomino Juan Carlos, Sylvia Cardoso Leão, Viviana Ritac, Tuberculosis 2007 from basic science to patient care: 26–r27: 31: 32–34: 35: 95:102:104:157:159:164:169:488–489:505–507: 593–595 (2007).

Google Scholar

[2]

H.L. Collins, S.H.E. KaufmannAcquired immunity against bacteria

S.H.E. Kaufmann, A. Sher, R. Ahmed (Eds.), Immunology of Infectous Diseases, ASM Press, Washington DC (2002), pp. 207-221 Chapter 15

CrossRefGoogle Scholar

[3]

E. Jouanguy, R. Doffinger, S. Dupuis, A. Pallier, F. Altare, J.L. CasanovaIL-12 and IFNgamma in host defense against mycobacteria and salmonella in mice and men Curr. Opin. Immunol., 11 (1999), pp. 346-351

ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

 

Η ΠΟΛΥΠΛΟΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΣΧΕΣΗΣ ΤΗΡΗΣΗΣ-ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ: ΓΙΑΤΙ ΕΙΜΑΣΤΕ ΑΚΟΜΑ ΣΤΟ ΣΚΟΤΑΔΙ ΚΑΙ ΠΩΣ ΜΠΟΡΟΥΜΕ ΝΑ ΒΓΟΥΜΕ ΑΠΟ ΑΥΤΟ;

Jossy van den Boogaard, Martin J. Boeree, Gibson S. Kibiki and Rob E. Aarnoutse

Η φυματίωση (TB) αποτελεί σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Περισσότεροι από 9 εκατομμύρια άνθρωποι διαγιγνώσκονται με ενεργό φυματίωση κάθε χρόνο και 1,6 εκατομμύρια άνθρωποι πεθαίνουν από την νόσο (ΠΟΥ 2010). Το συνιστώμενο θεραπευτικό σχήμα για νεοδιαγνωσθείσα, ευαίσθητη στα φάρμακα φυματίωση αποτελείται από:

- μια εντατική φάση με ισονιαζίδη, ριφαμπικίνη, πυραζιναμίδη και προαιρετικά αιθαμβουτόλη για δύο μήνες

- ακολουθούμενη από μια φάση συνέχισης 4 μηνών με ισονιαζίδη και ριφαμπικίνη που χορηγούνται ημερησίως ή περιοδικά (WHO 2003)

Το σχήμα μπορεί να επιτύχει ποσοστά θεραπευτικής επιτυχίας > 95% σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση και θετική μικροσκόπηση επιχρίσματος που υποβάλλονται σε θεραπεία υπό βέλτιστες συνθήκες. Ωστόσο, τα πραγματικά ποσοστά επιτυχίας της θεραπείας είναι 86% κατά μέσο όρο και κάτω από 80% στο ένα τέταρτο από τις 22 χώρες με το υψηλότερο "βάρος" της φυματίωσης (ΠΟΥ 2010).

Τα δυσμενή αποτελέσματα της θεραπείας οφείλονται σε μεγάλο βαθμό στη μη τήρηση της θεραπείας, καθώς έτσι αυξάνεται και ο κίνδυνος αποτυχίας της θεραπείας, της υποτροπής και της ανθεκτικής σε φάρμακα φυματίωσης. Ειδικότερα, η εμφάνιση πολυανθεκτικής και εκτεταμένα ανθεκτικής στα φάρμακα φυματίωσης είναι μια τεράστια απειλή για την παγκόσμια υγεία, η οποία σχετίζεται με τη μη τήρηση της θεραπείας.

Αν και το πρόβλημα της μη τήρησης της θεραπείας της φυματίωσης αναγνωρίζεται ευρέως, λίγα είναι γνωστά για το πώς ακριβώς τα διαφορετικά επίπεδα οι τύποι της επηρεάζουν την έκβαση της θεραπείας. Το γεγονός ότι είναι δυνατή η διαλείπουσα χορήγηση της δοσολογίας στη θεραπεία της φυματίωσης (WHO 2003) υποδεικνύει ότι είναι αποδεκτός ένας ορισμένος βαθμός ευελιξίας στα δοσολογικά σχήματα. Επιπλέον, παρόλο που ο πρόωρος τερματισμός της θεραπείας αυξάνει τον κίνδυνο αποτυχίας της θεραπείας και υποτροπής, η ακριβής σχέση μεταξύ αυτής της αύξησης του κινδύνου και της διάρκειας της θεραπείας μέχρι τη διακοπή είναι άγνωστη. Οι κατευθυντήριες οδηγίες για τη διαχείριση των ασθενών που διέκοψαν τη θεραπεία της φυματίωσης βασίζονται στις γνώμες των ειδικών, αλλά στερούνται σαφών επιστημονικών αποδείξεων.

Οι περισσότερες οδηγίες διαφοροποιούνται μεταξύ της διακοπής της θεραπείας στην εντατική φάση έναντι της διακοπής στη φάση συνέχισης της θεραπείας, λαμβάνοντας παράλληλα υπόψη τη χρονική διάρκεια των διακοπών, την σοβαρότητα της νόσου (σπηλαιώδη έναντι μη σπηλαιώδους νόσου) και τα αποτελέσματα του επιχρίσματος πτυέλων μετά από 2 μήνες θεραπείας (ATS / CDC / IDSA 2003).

Η συνήθης ορθότερη σύσταση είναι να παρατείνεται η διάρκεια της θεραπείας, αλλά συγκεκριμένα στοιχεία σχετικά με το χρονικό διάστημα που θα πρέπει αυτή να παραταθεί είναι σπάνια έως συνήθως μη υπαρκτά. Χωρίς σαφή κατανόηση της σχέσης μεταξύ των διαφορετικών επιπέδων και τύπων που αφορούν τη μη τήρηση και του θεραπευτικού αποτελέσματος, είναι αδύνατο να παρέχονται ξεκάθαρες συμβουλές σε κλινικούς ιατρούς και ασθενείς.

Εδώ θα εξηγήσουμε γιατί είμαστε ακόμα στο σκοτάδι όσον αφορά την πρόβλεψη του πώς τα διάφορα είδη μη τήρησης της θεραπείας της φυματίωσης επηρεάζουν την έκβαση του θεραπευτικού αποτελέσματος. Θα τονισθούν οι δυσκολίες καθορισμού και μέτρησης της επιτυχίας της θεραπείας και τήρησης της θεραπείας και θα εξετάσουμε με συντομία τους ενδιάμεσους παράγοντες που διαμορφώνουν την πορεία από την τήρηση της θεραπείας μέχρι το αποτέλεσμά της. Τέλος, θα συνοψίσουμε τις στρατηγικές και τις ερευνητικές προσεγγίσεις που απαιτούνται για τον εντοπισμό της σχέσης τήρησης-απόκρισης στη θεραπεία της φυματίωσης.

ΠΩΣ ΟΡΙΖΕΤΑΙ ΚΑΙ ΜΕΤΡΑΤΑΙ Η ΜΗ ΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ

Η τήρηση της θεραπείας ορίζεται γενικά ως η έκταση με την οποία ο ασθενής ακολουθεί το συνταγογραφούμενο θεραπευτικό σχήμα.

Η μη τήρηση μπορεί να είναι:
(i) να μην λαμβάνει ο ασθενής κανένα φάρμακο
(ii) η πρόωρη διακοπή της θεραπείας
ή (iii) η απόκλιση από τη συνταγογραφούμενη θεραπεία με άλλο τρόπο, συμπεριλαμβανομένων των βραχυχρόνιων διακοπών της αγωγής και της υπερβολικά υψηλής ή χαμηλής δόσης

Η τελευταία αυτή κατηγορία είναι στην πραγματικότητα μια δεξαμενή οποιουδήποτε τύπου μη τήρησης μιας θεραπείας πριν από τον τερματισμό της. Η διαφοροποίηση μεταξύ κατηγοριών και τύπων μη τήρησης μιας θεραπείας, η οποία σπάνια γίνεται ρητά στην υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με τη φυματίωση, είναι σημαντική για δύο λόγους:

α) Πρώτον, ο αντίκτυπος της μη τήρησης στο αποτέλεσμα της θεραπείας εξαρτάται από το είδος της και τη χρονική στιγμή (δηλ. σε ποια φάση της θεραπείας) της μη τήρησης.

β) Δεύτερον, τα διαφορετικά είδη οργανισμών των ασθενών θεωρείται ότι επηρεάζονται από διαφορετικούς τύπους μη τήρησης της θεραπείας και έτσι οι θεραπευτικές παρεμβάσεις που συστήνουν μια συγκεκριμένη τήρηση της θεραπείας μπορεί να μην έχουν το ίδιο αποτέλεσμα σε όλους τους τύπους ασθενών που δεν τήρησαν τη θεραπεία τους.

Τα προγράμματα ελέγχου της φυματίωσης επικεντρώνονται κυρίως σε αυτούς που για κάποιο λόγο δεν τήρησαν τη θεραπεία τους, δηλαδή σε ασθενείς που διέκοψαν τη θεραπεία για τουλάχιστον δύο συνεχείς μήνες (ΠΟΥ 2002). Αν και τα ποσοστά αθέτησης είναι σχετικά εύκολο να μετρηθούν, δεν μας πληροφορούν και για άλλους τύπους μη τήρησης. Ένας ακριβέστερος αλλά λιγότερο εύκολα μετρήσιμος δείκτης είναι ο ρυθμός τήρησης, που είναι η αναλογία των συνταγογραφούμενων δόσεων που λαμβάνονται από έναν ασθενή σε μια καθορισμένη περίοδο. Το κύριο πρόβλημα όσον αφορά τον ρυθμό τήρησης είναι η απουσία ενός gold standard για τη μέτρηση της τήρησης μιας θεραπείας. Η υπερεκτίμηση ή η υποεκτίμηση της τήρησης είναι συνήθης όταν χρησιμοποιείται ένας μόνο τρόπος μέτρησης και συνεπώς συνιστάται ένας συνδυασμός άμεσων και έμμεσων τρόπων μέτρησης, αν και σπάνια εφαρμόζεται.

Τα άμεσα μέτρα περιλαμβάνουν εκείνα που ανιχνεύουν την παρουσία φαρμάκων στο πλάσμα ή τα ούρα. Οι δοκιμασίες ούρων για την ισονιαζίδη χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο στα νοσοκομεία καθώς είναι εύκολες στη χρήση, ιδιαίτερα ευαίσθητες και ειδικές. Ωστόσο, οι άμεσοι τρόποι μέτρησης της τήρησης δεν ανιχνεύουν πάντα όλους τους τύπους μη τήρησης, καθώς πραγματοποιούνται μόνο για τις περιόδους σύντομων φαρμακευτικών αγωγών.

Τα έμμεσα μέτρα, όπως η εκτίμηση από τυποποιημένα ερωτηματολόγια και μετρήσεις των χαπιών, καλύπτουν μεγαλύτερες περιόδους, αλλά υποδηλώνουν και όχι αποδεικνύουν ότι οι ασθενείς έλαβαν πραγματικά το φάρμακο.

ΠΩΣ ΟΡΙΖΕΤΑΙ ΚΑΙ ΜΕΤΡΑΤΑΙ Η ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ

Εκτός από τον ορισμό του σημείου που αρχίζει η σχέση τήρησης-απόκρισης στη θεραπεία, πρέπει να συμφωνηθεί και σε ποιο μετρήσιμο τελικό σημείο αυτή στοχεύει. Το πιο προφανές τελικό σημείο είναι το αποτέλεσμα της θεραπείας κατά τη λήξη της. Η ταξινόμηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας και της χρονικής της διάρκειας που αυτή χρησιμοποιείται στα προγράμματα ελέγχου της φυματίωσης έχει περιορισμένη αξία από την άποψη αυτή, διότι ενσωματώνει τόσο τα αποτελέσματα που αφορούν την ασθένεια όσο και τη θεραπεία.

Η ταξινόμηση διαφοροποιείται:
- μεταξύ «θεραπείας», «αποτυχίας» και «θανάτου» ως αποτελεσμάτων της νόσου
- και μεταξύ «θεραπείας που ολοκληρώθηκε», «μη τήρησης της θεραπείας» και «παραίτηση από τη θεραπεία» ως θεραπευτικών αποτελεσμάτων (WHO 2002).

Η διαφοροποίηση μεταξύ των αποτελεσμάτων της θεραπείας της νόσου και της αποτυχίας της θεραπείας βασίζεται στη μικροσκόπηση επιχρισμάτων μετά από 5 και 6 μήνες θεραπείας ασθενών που διαγνώστηκαν με πνευμονική φυματίωση θετικού επιχρίσματος πτυέλων (WHO 2002). Το πρόβλημα είναι ότι η μικροσκόπηση επιχρίσματος έχει περιορισμένη ευαισθησία και ειδικότητα και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην παρακολούθηση των ασθενών με φυματίωση και αρνητικό επίχρισμα, οι οποίοι αποτελούν πάνω από το ήμισυ των ενεργών περιπτώσεων φυματίωσης παγκοσμίως (WHO 2010). Από την άλλη πλευρά, τα αποτελέσματα της θεραπείας αντικατοπτρίζουν τη συμπεριφορά του ασθενούς στο θεραπευτικό σχήμα και όχι τη βιολογική απόκριση στη θεραπεία. (Η βιοϊατρική περιλαμβάνει τη μελέτη ( παθο -) φυσιολογικών διεργασιών με μεθόδους από τη βιολογία και τη φυσιολογία . Αυτές οι διεργασίες μελετώνται με τον ιδιαίτερο στόχο της χάραξης νέων στρατηγικών διάγνωσης και θεραπείας)

Το αποτέλεσμα μιας θεραπείας που ολοκληρώθηκε χρησιμοποιείται ως μέτρο επιτυχίας της θεραπείας σε ασθενείς που ολοκλήρωσαν τη θεραπεία τους και στους οποίους δεν μπορούσαν να ληφθούν επιχρίσματα πτυέλων, αλλά σαφώς δεν αποτελεί άμεσο δείκτη βιολογικής απάντησης στη θεραπεία, τι ακριβώς δηλαδή συμβαίνει μέσα στο σώμα.

Η επίκτητη αντοχή στα φάρμακα είναι επίσης δείκτης της μη τήρησης και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως τελικό σημείο στη σχέση τήρησης-απόκρισης. Η διάγνωση της επίκτητης αντοχής στα φάρμακα περιλαμβάνει τη συνήθη δοκιμασία ευαισθησίας στα φάρμακα πριν από τη θεραπεία (για επιβεβαίωση ότι δεν υπάρχει εγγενής αντοχή στα φάρμακα) και την επανάληψη κατά τη διάρκεια της πορείας της θεραπείας. Απαιτεί να υπάρχουν εγκαταστάσεις δοκιμών καλλιέργειας και ευαισθησίας στα φάρμακα που λείπουν σε πολλές περιοχές με περιορισμένους πόρους (WHO 2003).

Το ποσοστό υποτροπής είναι ένας άλλος σημαντικός δείκτης επιτυχίας της θεραπείας. Η υποτροπή ορίζεται ως η επανεμφάνιση/αναζωπύρωση της ενεργού φυματίωσης μετά από επιτυχή αγωγή (WHO 2002). Σε κλινικές μελέτες, οι περίοδοι παρακολούθησης για 1-2 χρόνια μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας πραγματοποιούνται συνήθως για τον προσδιορισμό του ποσοστού υποτροπής. Ωστόσο, η μακροχρόνια παρακολούθηση μεμονωμένων ασθενών για τη συσχέτιση των ποσοστών υποτροπής με τον βαθμό τήρησης κατά την αρχική πορεία θεραπείας (εντατική φάση) αναδρομικά, είναι δύσκολο να επιτευχθεί στην κοινότητα. Επιπλέον, σε έλλειψη μοριακών τεχνικών, είναι δύσκολο να γίνει διάκριση μεταξύ αληθούς υποτροπής και νέας λοίμωξης (διάκριση στελεχών).

ΟΙ ΕΝΔΙΑΜΕΣΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΤΗΡΗΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ

Ιδανικά, θα μπορούσε κανείς να χρησιμοποιήσει την επιτυχία της θεραπείας ως δείκτη της τήρησης του ασθενούς στη θεραπεία. Ωστόσο, εκτός από το γεγονός ότι δεν υπάρχει σαφής, εύκολα μετρήσιμος δείκτης επιτυχίας της θεραπείας, η πορεία από την τήρηση μέχρι την απόκριση στη θεραπεία διαμορφώνεται από τέσσερις παράγοντες που είναι μερικώς μόνο κατανοητοί:
- παθογόνοι
- ανοσολογικοί
- φαρμακοκινητικοί
- και φαρμακοδυναμικοί παράγοντες

Πρώτα απ 'όλα, πολλά από τα χαρακτηριστικά του Mycobacterium tuberculosis (MTB) δεν είναι ακόμη ξεκάθαρα. Το ΜΤΒ είναι ένα παθογόνο που πολλαπλασιάζει αργά με την ικανότητα προσαρμογής σε διάφορα φυσικά περιβάλλοντα. Μπορεί να επιζήσει σε στερεά, τυρώδη υλικά και στο όξινο εσωτερικό περιβάλλον των μακροφάγων και των μονοκυττάρων για χρόνια, ενώ πολλαπλασιάζεται μόνο σποραδικά. Θεωρείται ότι αυτή η κατάσταση «αδράνειας» είναι υπεύθυνη για την υποτροπή της φυματίωσης.

Δεύτερον, η πολύπλοκη, πολυκυττάρια ανοσοαπόκριση του ξενιστή στο ΜΤΒ συμβάλλει στην αποτελεσματική αναχαίτιση της ενεργού φυματίωσης και ως εκ τούτου η κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή καθορίζει το αποτέλεσμα της θεραπείας της φυματίωσης.

Τρίτον, η μεταβλητότητα μεταξύ των ασθενών στις συγκεντρώσεις των φαρμάκων της φυματίωσης στο πλάσμα είναι συχνή και δεν αποδίδεται πάντοτε στη μη τήρηση της θεραπείας από τον ασθενή. Η ποικιλομορφία στη φαρμακοκινητική (δηλ. η σχέση μεταξύ της χορηγούμενης δόσης φαρμάκου και των διαδοχικών συγκεντρώσεων του φαρμάκου στο πλάσμα) παίζει επίσης ρόλο.

Τέταρτον, οι μηχανισμοί με τους οποίους οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου στο πλάσμα τελικά οδηγούν στην εκρίζωση του ενεργού πολλαπλασιασμού και των επίμονων βακίλων (φαρμακοδυναμική) δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Πρόσφατες in vitro και σε ζώα μελέτες έδειξαν ότι η βακτηριοκτόνος δράση των φαρμάκων πρώτης γραμμής κατά της φυματίωσης καθορίζεται κυρίως από:
- την σχέση του φαρμάκου και ενός παράγοντα μεταξύ της έκθεσης στα διάφορα φάρμακα που εκφράζεται ως η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης πλάσματος-χρόνου (AUC)
- και την ευαισθησία των μυκοβακτηριδίων μετρούμενη με την ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC).

Αυτό σημαίνει ότι η μεγιστοποίηση της έκθεσης (μέσω της αύξησης της δόσης και κατά συνέπεια της αύξησης των μέγιστων συγκεντρώσεών της στο πλάσμα και / ή της αύξησης της συχνότητας δόσης) (αντί της διατήρησης των συγκεντρώσεων των χορηγούμενων δόσεων στο πλάσμα πάνω από ένα ελάχιστο επίπεδο καθ 'όλη τη διάρκεια του χρονικού διαστήματος της δόσης) είναι η βασική απαίτηση για την αποτελεσματική θεραπεία της φυματίωσης. Είναι μία από τις εξηγήσεις για τη δυνατότητα διαλείπουσας δοσολογίας στη χορήγηση των φαρμάκων για τη θεραπεία της φυματίωσης.

Τέλος, οι μηχανισμοί με τους οποίους οι μη επαρκείς συγκεντρώσεις φαρμάκων οδηγούν σε μυκοβακτηριακή αντοχή δεν έχουν ακόμη αποκαλυφθεί πλήρως. Σύμφωνα με μια θεωρία, ο κίνδυνος μυκοβακτηριακής αντοχής σχετίζεται με: 

1) την αναλογία μεταξύ της μέγιστης συγκέντρωσης στο πλάσμα (Cmax) και της MIC για τη ριφαμπικίνη

2) την αναλογία μεταξύ της έκθεσης AUC και της MIC για την ισονιαζίδη

3) και τον χρόνο κατά τον οποίο η συγκέντρωση του φαρμάκου είναι πάνω από την MIC για την πυραζιναμίδη και την αιθαμβουτόλη

Σύμφωνα με μια άλλη θεωρία ο κίνδυνος ενίσχυσης των ανθεκτικών μεταλλαγμένων στελεχών:

1) αυξάνεται με το χρόνο στον οποίο η συγκέντρωση του φαρμάκου βρίσκεται στο παράθυρο επιλογής του μεταλλαγμένου στελέχους (MSW) το οποίο καλύπτει το εύρος συγκεντρώσεων μεταξύ της ελάχιστης συγκέντρωσης που αναστέλλει το 99% (MIC99) και της συγκέντρωσης που εμποδίζει την ενίσχυση του μεταλλαγμένου υποπληθυσμού που είναι λιγότερο ευαίσθητος στα φάρμακα (συγκέντρωση πρόληψης μετάλλαξης, MPC).

Ο ΔΡΟΜΟΣ ΠΟΥ ΕΚΤΕΙΝΕΤΑΙ ΜΠΡΟΣΤΑ ΜΑΣ

Είναι σαφές ότι βρισκόμαστε ακόμα στο σκοτάδι όσον αφορά την πρόβλεψη της επίδρασης των διαφορετικών επιπέδων και τύπων μη τήρησης της θεραπείας της φυματίωσης στα αποτελέσματα της θεραπείας της:

1) δεν έχουμε ομοφωνία ως προς τον τρόπο με τον οποίο ορίζουμε και μετράμε την έλλειψη τήρησης

2) δεν έχουμε καθόλου εύκολα προσιτούς δείκτες επιτυχίας της θεραπείας

3) και η σχέση μεταξύ τήρησης και αποτελέσματος της θεραπείας επηρεάζεται από έναν αριθμό παθογόνων, ανοσολογικών και φαρμακολογικών παραγόντων που είναι μερικώς μόνο κατανοητοί.

Για να αποφευχθεί η σύγχυση στους ασθενείς και τους κλινικούς γιατρούς, η καλύτερη συμβουλή είναι να εξασφαλίζεται 100% τήρηση της θεραπείας. Για το σκοπό αυτό, η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (ΠΟΥ) εισήγαγε τη στρατηγική άμεσης παρακολούθησης της θεραπείας (DOT) στις αρχές της δεκαετίας του 1990 (ΠΟΥ 2002). Ωστόσο, εκτός από το γεγονός ότι η παροχή της DOT δεν είναι εφικτή σε όλα τα περιβάλλοντα λόγω του μεγάλου φόρτου εργασίας και των προβλημάτων που δημιουργεί σε πολλούς ασθενείς, επίσης δεν εγγυάται τη βέλτιστη τήρηση της θεραπείας από όλους τους ασθενείς.

Η εναλλακτική μείζονα στρατηγική που θα μπορούσε να βοηθήσει στην εξασφάλιση 100% τήρηση είναι η συντόμευση της διάρκειας της θεραπείας. Πολλές νέες ενώσεις που έχουν τη δυνατότητα να συντομεύσουν τη θεραπεία της φυματίωσης βρίσκονται σε προκλινικό στάδιο ανάπτυξης. Ωστόσο, οι προκλήσεις της ανάπτυξης αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων θεραπείας της TB μικρότερης διάρκειας είναι πολλαπλές και πιθανότατα θα χρειαστεί ακόμα χρόνος πριν από τη διάθεση νέων θεραπευτικών σχημάτων σε ασθενείς παγκοσμίως. Εν τω μεταξύ, η επέκταση ερευνητικών δραστηριοτήτων που συμβάλλουν σε μια πιο λεπτομερή κατανόηση της σχέσης τήρησης-απόκρισης στη θεραπεία της φυματίωσης θα αποδειχθεί ικανοποιητική γιατί θα παρέχει καθοδήγηση στη διαχείριση των ασθενών που δεν τηρούν τη θεραπεία τους και θα συμβάλει στην ανάπτυξη παρεμβάσεων που θα προάγουν την τήρηση. Επιπλέον, θα συμβάλει στην κατανόηση των παθογόνων, ανοσολογικών και φαρμακολογικών παραγόντων που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της θεραπείας. Έτσι θα βοηθηθεί η ανάπτυξη νέων, αποτελεσματικών θεραπευτικών αγωγών.

Δύο προσεγγίσεις θα μπορούσαν να ληφθούν υπόψη για τη χαρτογράφηση της σχέσης μεταξύ τήρησης και έκβασης της θεραπείας:
- μελέτες παρατήρησης σε ασθενείς με ΤΒ
- και πειραματικές μελέτες σε in vitro και ζωικά μοντέλα

Εκτός από τα μέτρα για την αξιολόγηση της τήρησης, θα πρέπει να αναπτυχθούν εύκολα και πρώιμα προσπελάσιμοι δείκτες αποτελεσμάτων. Επιπρόσθετοι δείκτες για την έκβαση της θεραπείας όπως:
- διαδοχικές μετρήσεις των αριθμών των αποικιών των πτυέλων
- οι βακτηριοκτόνοι προσδιορισμοί των φαρμάκων σε πλήρες αίμα
- ο χρόνος για την θετικοποίηση της καλλιέργειας σε υγρά μέσα
- και οι ανοσολογικοί και μοριακοί δείκτες
θα πρέπει να αξιολογούνται για την ευαισθησία και την ειδικότητά τους στην κλινική πρακτική και στις συνεχιζόμενες μελέτες για νέα θεραπευτικά σχήματα TB. Η χρήση τέτοιων τεχνολογιών απαιτεί την αναβάθμιση της εργαστηριακής ικανότητας στις εγκαταστάσεις νοσοκομειακών χώρων με περιορισμένους πόρους, στις οποίες ζουν οι περισσότεροι ασθενείς με φυματίωση. Οι εγκαταστάσεις διεξαγωγής καλλιέργειας και ευαισθησίας στα φάρμακα πρέπει να είναι ευρύτερα διαθέσιμες ώστε να είναι σε θέση να ανιχνεύσουν την επίκτητη αντοχή στα φάρμακα, έναν σημαντικό δείκτη μη τήρησης της θεραπεία της φυματίωσης.

Συμπερασματικά, απαιτείται μια ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ «ΠΑΓΚΟΥ ΚΑΙ ΚΛΙΝΗΣ»:
1) για τον προσδιορισμό της σχέσης μεταξύ τήρησης της θεραπείας της φυματίωσης και επιτυχίας της θεραπείας
2) όπως και για την πρόβλεψη του τρόπου με τον οποίο οι διάφοροι τύποι μη τήρησης επηρεάζουν το αποτέλεσμα της θεραπείας.

Η λεπτομερής κατανόηση της σχέσης τήρησης-απόκρισης στη θεραπεία της φυματίωσης θα μας παρέχει βασικές γνώσεις που βοηθούν στην παρακολούθηση και την παροχή συμβουλών στους ασθενείς με στόχο την ανάπτυξη παρεμβάσεων που προωθούν την τήρηση.

References

American Thoracic Society (ATS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) & Infectious Diseases Society of America (2003) Treatment of tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 167, 603–662.

Chen YC, Chang HC, Chen CJ et al. (2010) Blood absolute T cell  counts may predict 2-month treatment response in patients with pulmonary tuberculosis. Disease Markers 28, 343–352.

Cook GM, Berney M, Gebhard S et al. (2009) Physiology of mycobacteria. Advances in Microbial Physiology 55, 81–89.

De Steenwinkel JE, De Knegt GJ, Ten Kate MT et al. (2009) Immunological parameters to define infection progression and therapy response in a well-defined tuberculosis model in mice. International Journal of Immunopathology and Pharmacology 22, 723–734.

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΟΥ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: ΕΝΑ ΟΥΣΙΑΣΤΙΚΟ ΖΗΤΗΜΑ ΓΙΑ IN VITRO ΔΟΚΙΜΕΣ

 https://doi.org/10.1002/mbo3.588

 

Τα ενδοκυττάρια παθογόνα όπως το Mycobacterium tuberculosis (η κύρια αιτία της φυματίωσης) και τα παράσιτα όπως το Plasmodium falciparum (η κύρια αιτία της ελονοσίας) και ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) που προκαλεί το σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) αναγνωρίζονται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ως υπεύθυνα για το ένα τρίτο των ετήσιων θανάτων στις αναπτυσσόμενες χώρες (ΠΟΥ, 2017).

Πολλές μελέτες σχετικά με αυτά τα παθογόνα έχουν προσανατολιστεί προς την αναγνώριση των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-παθογόνου καθιστώντας έτσι απαραίτητους τους in vitro προσδιορισμούς της κυτταρικής μόλυνσης. Η αναγνώριση και η ποσοτικοποίηση ενός παθογόνου παράγοντα στον ενδοκυττάριο ή τον εξωκυττάριο χώρο (στην επιφάνεια του κυττάρου) έχει διαδραματίσει σημαντικό ρόλο και έχει εμπνεύσει τους ερευνητές να αναπτύξουν νέες μεθοδολογίες, διευκολύνοντας έτσι την ταχύτερη και αποτελεσματικότερη ανίχνευση των νόσων.

Εδώ θα επισημανθούν κάποιες από αυτές τις μεθοδολογίες ποσοτικοποίησης που χρησιμοποιούνται σε μελέτες του Μ. Tuberculosis όπως:

1) χρώση οξεάντοχων βακτηριδίων και μικροσκόπηση

2) φθορίζοντα αντισώματα ενάντια σε ενδοκυττάρια βακτήρια

3) ποσοτικοποίηση RT-PCR ζωντανού Μ. tuberculosis

4) ποσοτική κυτταρομετρία ροής ενδοκυττάριων βακτηρίων

5) και φθοριοσιμετρικές μεθόδους ενδοκυτταρικών παθογόνων.

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

Χρώση για μικροσκοπική ανίχνευση οξεάντοχων βακτηριδίων

Ακόμη και αν οι τεχνικές χρώσης για την ανίχνευση οξεάντοχων βακτηρίων προτάθηκαν ως διαγνωστική μέθοδος το 1882, χρειάστηκε πολύς χρόνος μέχρις ότου να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων μυκοβακτηριδίων, την ποσοτικοποίηση ή ακόμα και τη διαφοροποίηση τους. Η μεθοδολογία που προτείνεται περιελάμβανε μόλυνση πρωτόζωων του είδους Tetrahymena pyriformis με διαφορετικά στελέχη μυκοβακτηριδίων για την αξιολόγηση της φαγοκυττάρωσης και της ενδοκυτταρικής ανάπτυξης. Παρασκευάστηκαν επιχρίσματα σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες και βάφτηκαν με Ziehl-Neelsen και Ο-ροδαμίνη Β ακολουθώντας τις τυπικές διαδικασίες. Οι πλάκες παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο. Οι συγγραφείς υποστήριξαν ότι κατά την απεικόνιση των πρωτόζωων μετά από χρώση με ροδαμίνη έγινε δυνατή η διαφοροποίηση των βακτηριδίων μεταξύ αυτών που ήταν μέσα σε αυτά και αυτών των οποίων δεσμεύονταν έξω από ένα κύτταρο. Αναλύθηκαν 50-100 πρωτόζωα (χωρίς να παρατηρηθούν τα εξωκυττάρια συσσωματώματα μυκοβακτηριδίων) τα οποία είχαν περισσότερα από 15 μυκοβακτηρίδια. Η παρατήρηση στο μικροσκόπιο με την ανωτέρω χρώση αποκάλυψε μυκοβακτηρίδια στο 100% των δειγμάτων των ασθενών σε σύγκριση με την 27,6% ευαισθησία ανίχνευσης με τη συνήθη χρώση. Τα δείγματα με αουραμίνη-Ο ακολούθως σημάνθηκαν από φθορίζοντα αντισώματα για την οριοθέτηση της μεμβράνης, χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντισώματα δεσμευμένα με βιοτίνη (παρέχοντας φθορίζουσα σήμανση μέσω σύζευξης με στρεπταβιδίνη) όπως τα αντι-CD11b, αντι-ΕD1, αντι-CD3 και αντι-CD20. (Η στρεπταβιδίνη και η αβιδίνη είναι πρωτεΐνες που δεσμεύονται με τη βιοτίνη με υψηλή συγγένεια. Τα συζεύγματα στρεπταβιδίνης με φθοριοφόρα ή ένζυμα χρησιμοποιούνται ως μέθοδο δευτερεύουσας επισήμανσης για την ανίχνευση βιοτινυλιωμένων μορίων όπως τα αντισώματα σε κοινές ερευνητικές εφαρμογές). Η φθορίζουσα σήμανση επιβεβαίωσε ότι η τροποποιημένη τεχνική Ziehl-Neelsen επέτρεψε τη χρώση, διαφοροποίηση και ποσοτικοποίηση των ενδοκυττάριων μυκοβακτηριδίων με υψηλή ευαισθησία χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό οπτικό μικροσκόπιο. Εντούτοις, αυτή η τεχνική έχει μειονεκτήματα όσον αφορά την παρατήρηση στο μικροσκόπιο για την ενδοκυττάρια μέτρηση του παθογόνου, λόγω του γεγονότος ότι μπορεί να αναλυθεί μια πολύ μικρή ποσότητα κυττάρων και ότι ελλοχεύει το ανθρώπινο λάθος όταν αποφασίζεται εάν τα μυκοβακτηρίδια ευρίσκονται εντός κυττάρων, στην επιφάνεια ή εκτός αυτών, πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με μελέτες που αφορούν τέτοιες εξετάσεις.

Ποσοτικός προσδιορισμός των ενδοκυττάριων βακτηριδίων (συμπεριλαμβανομένης της επισήμανσης με φθορίζοντα αντισώματα)

Έχουν αναπτυχθεί διάφορες μεθοδολογίες για την επιτάχυνση της ποσοτικοποίησης των ενδοκυττάριων παθογόνων, εκμεταλλευόμενοι τα φθοριοφόρα όσον αφορά την ευαισθησία και τις επιλογές που προσφέρονται από τον εξοπλισμό της ανίχνευσης και της μέτρησης. Κάθε μέθοδος παρουσιάζει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Σχεδόν όλες οι μελέτες που αναφέρονται χρησιμοποιούν τη μέθοδο μέτρησης με CFU για λόγους σύγκρισης, προτυποποίησης των μεθοδολογιών και επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων.

Η ποσοτικοποίηση των ενδοκυττάριων βακτηριδίων, που περιλαμβάνει φθορίζουσα σήμανση με αντισώματα, είναι η πρώτη στον κατάλογο και σχεδιάστηκε το 1985. Παρά τις κάποιες τροποποιήσεις σύμφωνα με τον παθογόνο, τα κύτταρα που μελετήθηκαν, και την εισαγωγή νέων φθοριοφόρων, οι αρχές της διαδικασίας παραμένουν οι ίδιες. Αφού τα κύτταρα μολυνθούν με παθογόνα, ξεπλένονται για να απομακρυνθεί η περίσσεια εξωκυττάριων βακτηριδίων, ακολουθούμενα από επιλεκτική σήμανση με αντισώματα. Ένα πρωτογενές αντίσωμα που αναγνωρίζει εξωκυττάρια βακτήρια προστίθεται (μιας και αυτά δεν μπορούν να εισέλθουν σε κύτταρα). Το μη δεσμευμένο αντίσωμα στη συνέχεια απομακρύνεται με πλύσεις. Ένα σημασμένο με φθοριοφόρο δευτερογενές αντίσωμα, συνήθως το TRITC που εκπέμπει ερυθρό φως, αναγνωρίζει δεσμευμένα αντισώματα στα βακτηρίδια. Μετά την επώαση, το αδέσμευτο δευτερογενές αντίσωμα απομακρύνεται με έκπλυση. Η κυτταρική μεμβράνη στη συνέχεια καθίσταται διαπερατή με μεθανόλη ή διάλυμα απορρυπαντικού και σημαίνεται με αντισώματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τα εξωκυττάρια βακτήρια, αλλά αυτή τη φορά χρησιμοποιείται δευτερογενές αντίσωμα το οποίο έχει επισημανθεί με άλλο φθοριοφόρο που εκπέμπει σε διαφορετική περιοχή του φάσματος (FITC -πράσινο φως).

Τα περισσότερα εξωκυττάρια βακτήρια άρα βάφονται με TRITC, ενώ τα ενδοκυττάρια βακτήρια σημαίνονται μόνο με φθοριοφόρο FITC. Τα βακτηρίδια ποσοτικοποιούνται οπτικά με μικροσκόπιο φθορισμού. Αυτή η τεχνική έχει παρόμοια με τα προηγούμενα μειονεκτήματα σχετικά με τη μικροσκόπηση. Στην περίπτωση αυτή συνοδεύεται από μεγάλη αύξηση του χρόνου της δοκιμασίας όπου γίνεται χρήση αντισωμάτων και του αριθμού των πλύσεων που απαιτούνται για αξιόπιστα αποτελέσματα της φθορίζουσας χρώσης. Ωστόσο, ο χρόνος για τη λήψη των αποτελεσμάτων είναι μικρότερος σε σύγκριση με τη μέθοδο καταγραφής αποικιών.

Ποσοτικοποίηση ζώντων μυκοβακτηριδίων της φυματίωσης με RT-PCR

Οι τεχνικές ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις τελευταίες δεκαετίες (ειδικά στον τομέα της διάγνωσης) περιλαμβάνουν τη χρήση ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR). Δύο διαγνωστικές τεχνικές RT-PCR αναπτύχθηκαν το 2003 για ανίχνευση Μ. Tuberculosis.

Η πρώτη τεχνική περιλαμβάνει αρχικά μια διαδικασία για τον καθαρισμό και την ομογενοποίηση των δειγμάτων των ασθενών. Στη συνέχεια φυγοκεντρούνται και το συμπυκνωμένο υλικό τοποθετείται σε σύστημα BACTEC και γίνεται και χρώση Ziehl-Neelsen ως έλεγχος. Το υπόλοιπο χρησιμοποιείται για εκχύλιση DNA, ενώ ένας βαθμονομητής προστίθεται πριν από την εκχύλιση του DNA για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της διαδικασίας. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν από δύο διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος του M. tuberculosis. Η πρώτη βρίσκεται σε όλα τα κλινικά απομονωμένα στελέχη του M. tuberculosis, ενώ η δεύτερη έχει περιγραφεί μόνο σε στελέχη του συμπλέγματος MTΒ. Χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρία UV για τον ποσοτικό προσδιορισμό των καμπυλών αναφοράς και επειδή σχεδιάστηκε για την ενίσχυση μιας μοναδικής αλληλουχίας για κάθε γονιδίωμα του M. tuberculosis, το βακτηριακό φορτίο είναι ευθέως ανάλογο με το φορτίο του DNA που μετριέται με αυτήν την τεχνική. Δεν περιορίζεται μόνο στη διαγνωστική χρήση. Η κατάλληλη επιλογή του γενετικού υλικού σε αυτή τη μέθοδο επιτρέπει την ποσοτικοποίηση των μυκοβακτηριδίων που έχουν ειδικά χαρακτηριστικά και μπορεί να εφαρμοστεί σε in vitro και in vivo δοκιμές.

Η δεύτερη τεχνική μπορεί να εφαρμοστεί ίη νίνο για παρακολούθηση της αντιγραφής του Μ. Tuberculosis σε μολυσμένα ποντίκια. Έχει προταθεί ότι το πλασμίδιο pBPIO είναι ένα κυκλοφορούν πλασμίδιο που φέρει έναν δείκτη αντοχής στην καναμυκίνη, συντασσόμενο με το βακτηριακό DΝΑ, που χάνεται με σταθερή και ποσοτικοποιήσιμη ταχύτητα στην κυτταρική διαίρεση. Ένας κυκλοποιητής χρησιμοποιήθηκε για RT-PCR. Η καμπύλη ποσοτικοποίησης κατασκευάστηκε με γονιδιακό DNA του Μ. Tuberculosis. Η ποσοτικοποίηση σε CFU από εκλεκτικό και μη εκλεκτικό θρεπτικό μέσο καθορίζει τους ρυθμούς διαίρεσης όσον αφορά την εξέλιξη/πορεία της λοίμωξης από Μ. Tuberculosis (πρακτικά μηδενική σε "αδρανή" φυματίωση). Η μέθοδος αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του λανθάνοντος βακτηριακού φορτίου του βιολογικού συστήματος ενός παθογόνου, χρησιμοποιώντας μόνο την RT-PCR, η οποία μπορεί να είναι πολύ χρήσιμη τόσο σε in vivo όσο και in vitro συστήματα.

Συμπεριλαμβάνονται βιοδείκτες όπως το ΡΜΑ ή το EMA σε τεχνικές PCR που καθιστούν δυνατή τη διαφοροποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ζώντων βακτηρίων. Η προτυποποίησή του για χρήση σε M. tuberculosis έχει προταθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό ζώντων μυκοβακτηριδίων σε δείγματα ασθενών ως διαγνωστική μέθοδο. Τα δείγματα των πτυέλων υποβλήθηκαν σε καθαρισμό με συγκεκριμένο τρόπο, ώστε ο κυτταρικός θάνατος του Μ. Tuberculosis να προκαλείται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Και οι δύο προαναφερθέντες βιοδείκτες αξιολογήθηκαν σε αυτή την προσέγγιση. Εντούτοις, βρέθηκε ότι το ΕΜΑ αναστέλλει την ενίσχυση των ζώντων κυττάρων, οπότε προτιμάται το ΡΜΑ. Ο εκκινητής ενίσχυσης περιέχει μια γονιδιακή περιοχή inhA-mabA που δεν έχει ομολογία με άλλα παθογόνα ή ευκαρυωτικά κύτταρα.

Μια καμπύλη της συγκέντρωσης του DNA με συμπληρωματική χρώση βρωμιούχου αιθίδιου καθιστά δυνατή την εξακρίβωση της ακριβούς ποσότητας βακίλλων σε κάθε δείγμα, διαφοροποιώντας τα ζώντα βακτήρια από τα μη ζώντα. Αυτή η μέθοδος είχε μεγαλύτερη ευαισθησία από τη χρώση Ziehl-Neelsen και εξαιρετική συσχέτιση με την καλλιέργεια των πτυέλων. Παρόλο που δεν υπάρχουν ακόμη αναφορές σχετικά με τη χρήση αυτής της τεχνικής σε δοκιμές in vitro και δεν επιτρέπει τη διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων βακτηρίων, είναι εξαιρετικά χρήσιμη στην ποσοτικοποίηση με υψηλή ακρίβεια του βακτηριακού φορτίου (ακόμη και σε μικρά δείγματα) και μαζί με μια καλή επιλογή από τις χρώσεις μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την  ανάλυση της βακτηριακής αντιγραφής, βιωσιμότητας και λοίμωξης. Τα μειονεκτήματα αυτής της τεχνικής αφορούν τον χρόνο που απαιτείται για τη λήψη των πλασμιδίων, το υψηλό κόστος των χρώσεων, των αντιδραστηρίων εκχύλισης και του εξειδικευμένου εξοπλισμού RT-PCR.

Ποσοτικοποίηση ενδοκυτταρικών βακτηριδίων με κυτταρομετρία ροής

Ωστόσο, έχει προταθεί ένα πρωτόκολλο που περιλαμβανει κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση παθογονων. Κάποιες τροποποιήσεις ήταν απαραίτητες για να  καταστεί δυνατή η μέτρηση των βακτηριδίων με κυτταρομετρητή. Τα βακτηρίδια επισημάνθηκαν μόνο με CFSE και στη συνέχεια επωάστηκαν με κύτταρα (20: 1) για δύο ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα απομονώθηκαν από το τρυβλίο με κατεργασία με τρυψίνη και πλύσιμο. Τα μολυσμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα. Τα ενδοκυττάρια βακτήρια διακρίθηκαν από τα εξωκυττάρια βακτήρια με την προσθήκη trypan blue αμέσως πριν από την ανάγνωση για να απενεργοποιηθεί ο φθορισμός των εξωκυττάριων βακτηρίων. Έχει προταθεί ότι αυτή η ένωση δεν μπορεί να εισέλθει σε ζωντανά κύτταρα που περιέχουν βακτήρια μέσα σε αυτά, αλλά θα μπορούσε να περιβάλλει τα βακτήρια στο εξωτερικό τους, απορροφώντας το φως που εκπέμπεται από αυτά. Έτσι ο εξοπλισμός θα μπορούσε να λάβει μόνο ένα σήμα αυτό από τα ενδοκυττάρια βακτήρια. Υπολογίστηκε ότι 10.000 κύτταρα ανά δείγμα διαβάζονται χρησιμοποιώντας ένα κυτταρομετρητή FACSCalibur. Το CFSE εκπέμπει σε πράσινο χρώμα που συλλέγεται στον ανιχνευτή FL1 του FACScan. Η τεχνική έχει τροποποιηθεί και έχει αξιολογηθεί με επιτυχία για τον αριθμό M. tuberculosis.

Η κυτταρομετρία έχει περισσότερα πλεονεκτήματα από άλλες τεχνικές όσον αφορά την ανάλυση δειγμάτων μεγάλου μεγέθους, καθιστώντας τα στατιστικά αντιπροσωπευτικά και είναι ακόμα πιο συμφέρουσα τεχνική, καθώς μπορεί να επιτρέψει τη διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων βακτηρίων. Ωστόσο, ένας κυτταρομετρητής ροής αυξάνει το κόστος επεξεργασίας, λαμβάνοντας υπόψη ειδικά ότι δεν είναι δυνατόν όλα τα εργαστήρια που έχουν κυτταρομετρητές να επεξεργάζονται παθογόνα όπως το Μ. Tuberculosis.

Η ανακάλυψη της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) έχει φέρει επανάσταση στη μελέτη των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-παθογόνου παρέχοντας ποικίλα πλεονεκτήματα. Οι φορείς της έκφρασης της φθορίζουσας πρωτεΐνης έχουν επίσης διευκολύνει την αξιολόγηση της γονιδιακής ρύθμισης εντός ενός κυττάρου του ξενιστή με δοκιμές προσδιορισμών προσβεβλημένων κυττάρων. Για παράδειγμα, μια μελέτη που χρησιμοποιεί το πλασμίδιο pLL192 περιελαμβάνει το σχεδιασμό φορέων ως εκκινητές για την έκφραση διαφορετικών πρωτεϊνών Μ. tuberculosis που σχετίζονται με γονίδια αναφοράς GFP (hsp60) ─ ένα γονίδιο αναφοράς  είναι ένα γονίδιο στο οποίο οι ερευνητές συνδέουν μια ρυθμιστική αλληλουχία ενός άλλου γονιδίου που τους ενδιαφέρει σε βακτήρια , κυτταροκαλλιέργεια, ζώα ή φυτά. Χρησιμοποιούνται συχνά ως ένδειξη του κατά πόσο ένα συγκεκριμένο γονίδιο έχει ληφθεί από ή εκφράζεται στον πληθυσμό κυττάρων ή οργανισμών  ─ και ανθεκτικότητας στην καναμυκίνης (kan) που βρέθηκαν  σε Ε. coli και ηλεκτροδιατρήθηκαν (προσωρινή απώλεια της ημιπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών, οδηγώντας έτσι σε διαρροή ιόντων, διαφυγή μεταβολιτών και αυξημένη πρόσληψη από τα κύτταρα φαρμάκων, μοριακών ανιχνευτών και DNA) σε Mycobacterium bovis BCG και Μ. Tuberculosis. Τα κυψελιδικά μακροφάγα ποντικών που έχουν μολυνθεί με επιμολυσμένα βακτηρίδια πλύθηκαν και κατεργάστηκαν με καναμυκίνη για να εξοντώσουν τα υπόλοιπα εξωκυττάρια βακτήρια ή εκείνα που ήταν συνδεδεμένα στην επιφάνειά τους. Τα κύτταρα λύθηκαν με ένα διάλυμα και μια ποσότητα δείγματος σπάρθηκε σε μέσο Middlebrook 7Η10 με αντιβιοτικά για τη μέτρηση του αριθμό CFU. Η ανάλυση των βακτηρίων με κυτταρομετρία ροής αποκάλυψε μεγαλύτερο φθορισμό σε εκείνες τις πρωτεΐνες που υπερεκφράζονται όταν τα βακτήρια υποβάλλονται σε στρες εντός των μακροφάγων, θεωρώντας ότι είναι γονίδια που έχουν επαγόμενη έκφραση στα μυκοβακτηρίδια (το mceA1 είναι ένα από αυτά).

Φθοριοσιμετρική μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενδοκυτταρικών παθογόνων

Μια νέα φθοριοσιμετρική μέθοδος μέτρησης της β-λακταμάσης με βάση την κυτταρομετρία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από παθογόνα και η διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων από τα εξωκυττάρια βακτήρια έχει σχεδιαστεί με επιτυχία για την ανίχνευση της ρήξης ενδοκυττάριων κενοτοπίων με M. tuberculosis.

Η μόλυνση των επεξεργασμένων μακροφάγων γίνεται με μυκοβακτηρίδια που εκφράζουν β-λακταμάση και διαχωρίζονται με υπερήχους, φιλτράρονται και τοποθετούνται σε κύτταρα. Στα μολυσμένα κύτταρα προστίθεται CCF4-AM που εκπέμπει στα 535 nm (πράσινο). Η β-λακταμάση πάνω στην μυκοβακτηριδιακή επιφάνεια είναι σε θέση να διασπάσει το υπόστρωμα CCF4-ΑΜ μόλις συμβεί η ρήξη του φαγοσώματος, μετατρέποντας τα κύτταρα σε μπλε (ανάγνωση στα 450 nm), όπου τα μη προσβεβλημένα είναι πράσινα. Τα κύτταρα δεν μεταβλήθηκαν σε μια δοκιμασία με Mycobacterium bovis BCG (ένα μη λοιμογόνο στέλεχος) επειδή βρίσκεται μόνο μέσα στο διαμέρισμα των φαγοσωμάτων. Τα δείγματα θα πρέπει να μικροσκοπούνται, επιτρέποντας την αυτόματη βαθμολόγηση σήματος φθορισμού για κάθε κύτταρο.

Αυτή είναι μια πολύ ακριβή μέθοδος λόγω του υψηλού κόστους του υποστρώματος CCF4-AM και του εξοπλισμού μέτρησης, αν και είναι χρήσιμη όσον αφορά την ανάλυση σε πραγματικό χρόνο και τη γνώση της αλληλεπίδρασης ξενιστή-παθογόνου από την άποψη της ποσοτικής μέτρησης. Δεν παρέχει πληροφορίες σχετικά με την ποσότητα των μυκοβακτηριδίων που μόλυναν κάθε κύτταρο. Μπορεί να δείξει μόνο πόσα κύτταρα έχουν μολυνθεί και έχει τα μειονεκτήματα που συνεπάγεται η χρήση μικροσκοπίου. Τα φθορίζοντα μυκοβακτηρίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποσοτική μέτρηση που προσδιορίζει την ποσότητα των ενδοκυττάριων βακτηρίων. Εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος από αυτά που αναφέρθηκαν προηγουμένως και μπορούν να αναλυθούν με κυτταρομετρία ροής.

Μελέτες που περιλαμβάνουν σήμερα φθοριοσιμετρική ανάλυση για την ποσοτικοποίηση βακτηρίων έχουν γίνει με βακτήρια και μυκοβακτηρίδια που εκφράζουν διαφορετικές φθορίζουσες πρωτεΐνες. Για παράδειγμα μια μεθοδολογία έχει επίσης προταθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενδοκυττάριων μυκοβακτηριδίων με το M. tuberculosis να εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη για μαζική μέτρηση με αυτοματοποιημένη μικροσκόπηση.

ΤΟ ΠΑΡΟΝ ΚΑΙ ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ

Οι πρόοδοι που έγιναν μέχρι σήμερα όσον αφορά την ανάπτυξη ποσοτικών τεχνικών για ενδοκυττάρια παθογόνα, η τάση για ανάλυση με βάση το φθορισμό και οι περιορισμοί κάθε τεχνικής υπογραμμίζουν την ύψιστη σημασία της συνεχούς διερεύνησης διαφορετικών τεχνικών για την ποσοτικοποίηση ενδοκυτταρικών μικροοργανισμών. Αυτά θα πρέπει να επικεντρωθούν ιδιαίτερα στην ποσοτικοποίηση του M. tuberculosis με μεθοδολογίες που να επιτρέπουν τη διαφοροποίηση των εξωκυττάριων μυκοβακτηριδίων από αυτά που δεσμεύονται στην επιφάνεια του κυττάρου στόχου, υπερνικώντας τον αδυναμία της μέτρησης του αριθμού των CFU για έναν μικροοργανισμό που σχηματίζει συσσωματώματα που έχει παρατεταμένο χρόνο ανάπτυξης και αποφεύγοντας τον περιορισμό της σημασίας που έχει ένα δείγμα που αναλύεται έμμεσα με τις τεχνικές που περιλαμβάνουν τη χρήση ενός μικροσκοπίου φθορισμού. Η ανάπτυξη τεχνικών ταχέος διαγνωστικού ελέγχου με βάση τη μέτρηση του φθορισμού, την απενεργοποίησή του ή και τα δύο είναι το παρόν και το μέλλον για την αποτελεσματική ποσοτικοποίηση και διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων παθογόνων. Είναι χρήσιμες στην ανάπτυξη φαρμάκων, εμβολίων και μεθόδων διάγνωσης χαμηλού κόστους τόσο χρονικά όσο και οικονομικά.

World TB Day 2019