Τα ενδοκυττάρια παθογόνα όπως το
Mycobacterium tuberculosis (η κύρια αιτία της φυματίωσης) και τα παράσιτα όπως
το Plasmodium falciparum (η κύρια αιτία της ελονοσίας) και ο ιός της ανθρώπινης
ανοσοανεπάρκειας (HIV) που προκαλεί το σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας
(AIDS) αναγνωρίζονται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ως υπεύθυνα για το ένα
τρίτο των ετήσιων θανάτων στις αναπτυσσόμενες χώρες (ΠΟΥ, 2017).
Πολλές μελέτες σχετικά με αυτά τα
παθογόνα έχουν προσανατολιστεί προς την αναγνώριση των αλληλεπιδράσεων
ξενιστή-παθογόνου καθιστώντας έτσι απαραίτητους τους in vitro προσδιορισμούς
της κυτταρικής μόλυνσης. Η αναγνώριση και η ποσοτικοποίηση ενός παθογόνου
παράγοντα στον ενδοκυττάριο ή τον εξωκυττάριο χώρο (στην επιφάνεια του
κυττάρου) έχει διαδραματίσει σημαντικό ρόλο και έχει εμπνεύσει τους ερευνητές
να αναπτύξουν νέες μεθοδολογίες, διευκολύνοντας έτσι την ταχύτερη και
αποτελεσματικότερη ανίχνευση των νόσων.
Εδώ θα επισημανθούν κάποιες από
αυτές τις μεθοδολογίες ποσοτικοποίησης που χρησιμοποιούνται σε μελέτες του Μ.
Tuberculosis όπως:
1) χρώση οξεάντοχων βακτηριδίων
και μικροσκόπηση
2) φθορίζοντα αντισώματα ενάντια
σε ενδοκυττάρια βακτήρια
3) ποσοτικοποίηση RT-PCR ζωντανού
Μ. tuberculosis
4) ποσοτική κυτταρομετρία ροής
ενδοκυττάριων βακτηρίων
5) και φθοριοσιμετρικές μεθόδους
ενδοκυτταρικών παθογόνων.
ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ
Χρώση για μικροσκοπική ανίχνευση οξεάντοχων βακτηριδίων
Ακόμη και αν οι τεχνικές χρώσης
για την ανίχνευση οξεάντοχων βακτηρίων προτάθηκαν ως διαγνωστική μέθοδος το
1882, χρειάστηκε πολύς χρόνος μέχρις ότου να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση
ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων μυκοβακτηριδίων, την ποσοτικοποίηση ή ακόμα και
τη διαφοροποίηση τους. Η μεθοδολογία που προτείνεται περιελάμβανε μόλυνση
πρωτόζωων του είδους Tetrahymena pyriformis με διαφορετικά στελέχη
μυκοβακτηριδίων για την αξιολόγηση της φαγοκυττάρωσης και της ενδοκυτταρικής
ανάπτυξης. Παρασκευάστηκαν επιχρίσματα σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες και
βάφτηκαν με Ziehl-Neelsen και Ο-ροδαμίνη
Β ακολουθώντας τις τυπικές διαδικασίες. Οι πλάκες παρατηρήθηκαν σε
μικροσκόπιο. Οι συγγραφείς υποστήριξαν ότι κατά την απεικόνιση των πρωτόζωων
μετά από χρώση με ροδαμίνη έγινε δυνατή η διαφοροποίηση των βακτηριδίων μεταξύ
αυτών που ήταν μέσα σε αυτά και αυτών των οποίων δεσμεύονταν έξω από ένα
κύτταρο. Αναλύθηκαν 50-100 πρωτόζωα (χωρίς να παρατηρηθούν τα εξωκυττάρια
συσσωματώματα μυκοβακτηριδίων) τα οποία είχαν περισσότερα από 15
μυκοβακτηρίδια. Η παρατήρηση στο μικροσκόπιο με την ανωτέρω χρώση αποκάλυψε
μυκοβακτηρίδια στο 100% των δειγμάτων των ασθενών σε σύγκριση με την 27,6%
ευαισθησία ανίχνευσης με τη συνήθη χρώση. Τα δείγματα με αουραμίνη-Ο ακολούθως
σημάνθηκαν από φθορίζοντα αντισώματα για την οριοθέτηση της μεμβράνης,
χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντισώματα δεσμευμένα με βιοτίνη (παρέχοντας
φθορίζουσα σήμανση μέσω σύζευξης με στρεπταβιδίνη) όπως τα αντι-CD11b, αντι-ΕD1, αντι-CD3 και αντι-CD20. (Η
στρεπταβιδίνη και η αβιδίνη είναι πρωτεΐνες που δεσμεύονται με τη βιοτίνη με
υψηλή συγγένεια. Τα συζεύγματα στρεπταβιδίνης με φθοριοφόρα ή ένζυμα
χρησιμοποιούνται ως μέθοδο δευτερεύουσας επισήμανσης για την ανίχνευση
βιοτινυλιωμένων μορίων όπως τα αντισώματα σε κοινές ερευνητικές εφαρμογές). Η
φθορίζουσα σήμανση επιβεβαίωσε ότι η τροποποιημένη τεχνική Ziehl-Neelsen
επέτρεψε τη χρώση, διαφοροποίηση και ποσοτικοποίηση των ενδοκυττάριων
μυκοβακτηριδίων με υψηλή ευαισθησία χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό οπτικό
μικροσκόπιο. Εντούτοις, αυτή η τεχνική έχει μειονεκτήματα όσον αφορά την
παρατήρηση στο μικροσκόπιο για την ενδοκυττάρια μέτρηση του παθογόνου, λόγω του
γεγονότος ότι μπορεί να αναλυθεί μια πολύ μικρή ποσότητα κυττάρων και ότι
ελλοχεύει το ανθρώπινο λάθος όταν αποφασίζεται εάν τα μυκοβακτηρίδια
ευρίσκονται εντός κυττάρων, στην επιφάνεια ή εκτός αυτών, πολύτιμες πληροφορίες
σχετικά με μελέτες που αφορούν τέτοιες εξετάσεις.
Ποσοτικός προσδιορισμός των ενδοκυττάριων βακτηριδίων
(συμπεριλαμβανομένης της επισήμανσης με φθορίζοντα αντισώματα)
Έχουν αναπτυχθεί διάφορες
μεθοδολογίες για την επιτάχυνση της ποσοτικοποίησης των ενδοκυττάριων
παθογόνων, εκμεταλλευόμενοι τα φθοριοφόρα όσον αφορά την ευαισθησία και τις
επιλογές που προσφέρονται από τον εξοπλισμό της ανίχνευσης και της μέτρησης.
Κάθε μέθοδος παρουσιάζει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Σχεδόν όλες οι
μελέτες που αναφέρονται χρησιμοποιούν τη μέθοδο μέτρησης με CFU για λόγους
σύγκρισης, προτυποποίησης των μεθοδολογιών και επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων.
Η ποσοτικοποίηση των
ενδοκυττάριων βακτηριδίων, που περιλαμβάνει φθορίζουσα σήμανση με αντισώματα,
είναι η πρώτη στον κατάλογο και σχεδιάστηκε το 1985. Παρά τις κάποιες
τροποποιήσεις σύμφωνα με τον παθογόνο, τα κύτταρα που μελετήθηκαν, και την
εισαγωγή νέων φθοριοφόρων, οι αρχές της διαδικασίας παραμένουν οι ίδιες. Αφού
τα κύτταρα μολυνθούν με παθογόνα, ξεπλένονται για να απομακρυνθεί η περίσσεια
εξωκυττάριων βακτηριδίων, ακολουθούμενα από επιλεκτική σήμανση με αντισώματα.
Ένα πρωτογενές αντίσωμα που αναγνωρίζει εξωκυττάρια βακτήρια προστίθεται (μιας
και αυτά δεν μπορούν να εισέλθουν σε κύτταρα). Το μη δεσμευμένο αντίσωμα στη
συνέχεια απομακρύνεται με πλύσεις. Ένα σημασμένο με φθοριοφόρο δευτερογενές
αντίσωμα, συνήθως το TRITC που εκπέμπει ερυθρό φως, αναγνωρίζει δεσμευμένα
αντισώματα στα βακτηρίδια. Μετά την επώαση, το αδέσμευτο δευτερογενές αντίσωμα
απομακρύνεται με έκπλυση. Η κυτταρική μεμβράνη στη συνέχεια καθίσταται
διαπερατή με μεθανόλη ή διάλυμα απορρυπαντικού και σημαίνεται με αντισώματα
όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τα εξωκυττάρια βακτήρια, αλλά αυτή τη φορά
χρησιμοποιείται δευτερογενές αντίσωμα το οποίο έχει επισημανθεί με άλλο
φθοριοφόρο που εκπέμπει σε διαφορετική περιοχή του φάσματος (FITC -πράσινο
φως).
Τα περισσότερα εξωκυττάρια
βακτήρια άρα βάφονται με TRITC, ενώ
τα ενδοκυττάρια βακτήρια σημαίνονται μόνο με φθοριοφόρο FITC. Τα βακτηρίδια ποσοτικοποιούνται οπτικά με μικροσκόπιο
φθορισμού. Αυτή η τεχνική έχει παρόμοια με τα προηγούμενα μειονεκτήματα σχετικά
με τη μικροσκόπηση. Στην περίπτωση αυτή συνοδεύεται από μεγάλη αύξηση του χρόνου
της δοκιμασίας όπου γίνεται χρήση αντισωμάτων και του αριθμού των πλύσεων που
απαιτούνται για αξιόπιστα αποτελέσματα της φθορίζουσας χρώσης. Ωστόσο, ο χρόνος
για τη λήψη των αποτελεσμάτων είναι μικρότερος σε σύγκριση με τη μέθοδο
καταγραφής αποικιών.
Ποσοτικοποίηση ζώντων μυκοβακτηριδίων της φυματίωσης με RT-PCR
Οι τεχνικές ανίχνευσης και
ποσοτικοποίησης των βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις τελευταίες
δεκαετίες (ειδικά στον τομέα της διάγνωσης) περιλαμβάνουν τη χρήση ποσοτικής
αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR). Δύο
διαγνωστικές τεχνικές RT-PCR αναπτύχθηκαν το 2003 για ανίχνευση Μ. Tuberculosis.
Η πρώτη τεχνική περιλαμβάνει
αρχικά μια διαδικασία για τον καθαρισμό και την ομογενοποίηση των δειγμάτων των
ασθενών. Στη συνέχεια φυγοκεντρούνται και το συμπυκνωμένο υλικό τοποθετείται σε
σύστημα BACTEC και γίνεται και χρώση Ziehl-Neelsen ως έλεγχος. Το υπόλοιπο
χρησιμοποιείται για εκχύλιση DNA, ενώ ένας βαθμονομητής προστίθεται πριν από
την εκχύλιση του DNA για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της διαδικασίας. Οι
εκκινητές σχεδιάστηκαν από δύο διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος του M.
tuberculosis. Η πρώτη βρίσκεται σε όλα τα κλινικά απομονωμένα στελέχη του M.
tuberculosis, ενώ η δεύτερη έχει περιγραφεί μόνο σε στελέχη του συμπλέγματος
MTΒ. Χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρία UV για τον ποσοτικό προσδιορισμό των
καμπυλών αναφοράς και επειδή σχεδιάστηκε για την ενίσχυση μιας μοναδικής
αλληλουχίας για κάθε γονιδίωμα του M. tuberculosis, το βακτηριακό φορτίο είναι
ευθέως ανάλογο με το φορτίο του DNA που μετριέται με αυτήν την τεχνική. Δεν
περιορίζεται μόνο στη διαγνωστική χρήση. Η κατάλληλη επιλογή του γενετικού
υλικού σε αυτή τη μέθοδο επιτρέπει την ποσοτικοποίηση των μυκοβακτηριδίων που
έχουν ειδικά χαρακτηριστικά και μπορεί να εφαρμοστεί σε in vitro και in vivo
δοκιμές.
Η δεύτερη τεχνική μπορεί να
εφαρμοστεί ίη νίνο για παρακολούθηση της αντιγραφής του Μ. Tuberculosis σε
μολυσμένα ποντίκια. Έχει προταθεί ότι το πλασμίδιο pBPIO είναι ένα κυκλοφορούν
πλασμίδιο που φέρει έναν δείκτη αντοχής στην καναμυκίνη, συντασσόμενο με το
βακτηριακό DΝΑ, που
χάνεται με σταθερή και ποσοτικοποιήσιμη ταχύτητα στην κυτταρική διαίρεση. Ένας
κυκλοποιητής χρησιμοποιήθηκε για RT-PCR. Η καμπύλη ποσοτικοποίησης
κατασκευάστηκε με γονιδιακό DNA του Μ. Tuberculosis. Η ποσοτικοποίηση σε CFU
από εκλεκτικό και μη εκλεκτικό θρεπτικό μέσο καθορίζει τους ρυθμούς διαίρεσης
όσον αφορά την εξέλιξη/πορεία της λοίμωξης από Μ. Tuberculosis (πρακτικά
μηδενική σε "αδρανή" φυματίωση). Η μέθοδος αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί
για τον προσδιορισμό του λανθάνοντος βακτηριακού φορτίου του βιολογικού
συστήματος ενός παθογόνου, χρησιμοποιώντας μόνο την RT-PCR, η οποία μπορεί να
είναι πολύ χρήσιμη τόσο σε in vivo όσο και in vitro συστήματα.
Συμπεριλαμβάνονται βιοδείκτες όπως
το ΡΜΑ ή το EMA σε τεχνικές PCR που καθιστούν δυνατή τη διαφοροποίηση και τον
ποσοτικό προσδιορισμό ζώντων βακτηρίων. Η προτυποποίησή του για χρήση σε M.
tuberculosis έχει προταθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό ζώντων μυκοβακτηριδίων
σε δείγματα ασθενών ως διαγνωστική μέθοδο. Τα δείγματα των πτυέλων υποβλήθηκαν
σε καθαρισμό με συγκεκριμένο τρόπο, ώστε ο κυτταρικός θάνατος του Μ.
Tuberculosis να προκαλείται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Και οι δύο
προαναφερθέντες βιοδείκτες αξιολογήθηκαν σε αυτή την προσέγγιση. Εντούτοις,
βρέθηκε ότι το ΕΜΑ αναστέλλει την ενίσχυση των ζώντων κυττάρων, οπότε
προτιμάται το ΡΜΑ. Ο εκκινητής ενίσχυσης περιέχει μια γονιδιακή περιοχή
inhA-mabA που δεν έχει ομολογία με άλλα παθογόνα ή ευκαρυωτικά κύτταρα.
Μια καμπύλη της συγκέντρωσης του
DNA με συμπληρωματική χρώση βρωμιούχου αιθίδιου καθιστά δυνατή την εξακρίβωση
της ακριβούς ποσότητας βακίλλων σε κάθε δείγμα, διαφοροποιώντας τα ζώντα
βακτήρια από τα μη ζώντα. Αυτή η μέθοδος είχε μεγαλύτερη ευαισθησία από τη
χρώση Ziehl-Neelsen και εξαιρετική συσχέτιση με την καλλιέργεια των πτυέλων.
Παρόλο που δεν υπάρχουν ακόμη αναφορές σχετικά με τη χρήση αυτής της τεχνικής
σε δοκιμές in vitro και δεν επιτρέπει τη διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων
βακτηρίων, είναι εξαιρετικά χρήσιμη στην ποσοτικοποίηση με υψηλή ακρίβεια του
βακτηριακού φορτίου (ακόμη και σε μικρά δείγματα) και μαζί με μια καλή επιλογή
από τις χρώσεις μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση της βακτηριακής αντιγραφής,
βιωσιμότητας και λοίμωξης. Τα μειονεκτήματα αυτής της τεχνικής αφορούν τον
χρόνο που απαιτείται για τη λήψη των πλασμιδίων, το υψηλό κόστος των χρώσεων,
των αντιδραστηρίων εκχύλισης και του εξειδικευμένου εξοπλισμού RT-PCR.
Ποσοτικοποίηση ενδοκυτταρικών βακτηριδίων με κυτταρομετρία ροής
Ωστόσο, έχει προταθεί ένα πρωτόκολλο
που περιλαμβανει κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση παθογονων. Κάποιες
τροποποιήσεις ήταν απαραίτητες για να
καταστεί δυνατή η μέτρηση των βακτηριδίων με κυτταρομετρητή. Τα
βακτηρίδια επισημάνθηκαν μόνο με CFSE και στη συνέχεια επωάστηκαν με κύτταρα
(20: 1) για δύο ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα απομονώθηκαν από το τρυβλίο με
κατεργασία με τρυψίνη και πλύσιμο. Τα μολυσμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε
ρυθμιστικό διάλυμα. Τα ενδοκυττάρια βακτήρια διακρίθηκαν από τα εξωκυττάρια
βακτήρια με την προσθήκη trypan blue αμέσως πριν από την ανάγνωση για να απενεργοποιηθεί ο
φθορισμός των εξωκυττάριων βακτηρίων. Έχει προταθεί ότι αυτή η ένωση δεν μπορεί
να εισέλθει σε ζωντανά κύτταρα που περιέχουν βακτήρια μέσα σε αυτά, αλλά θα
μπορούσε να περιβάλλει τα βακτήρια στο εξωτερικό τους, απορροφώντας το φως που
εκπέμπεται από αυτά. Έτσι ο εξοπλισμός θα μπορούσε να λάβει μόνο ένα σήμα αυτό
από τα ενδοκυττάρια βακτήρια. Υπολογίστηκε ότι 10.000 κύτταρα ανά δείγμα
διαβάζονται χρησιμοποιώντας ένα κυτταρομετρητή FACSCalibur. Το CFSE εκπέμπει σε
πράσινο χρώμα που συλλέγεται στον ανιχνευτή FL1 του FACScan. Η τεχνική έχει
τροποποιηθεί και έχει αξιολογηθεί με επιτυχία για τον αριθμό M. tuberculosis.
Η κυτταρομετρία έχει περισσότερα
πλεονεκτήματα από άλλες τεχνικές όσον αφορά την ανάλυση δειγμάτων μεγάλου
μεγέθους, καθιστώντας τα στατιστικά αντιπροσωπευτικά και είναι ακόμα πιο
συμφέρουσα τεχνική, καθώς μπορεί να επιτρέψει τη διαφοροποίηση των
ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων βακτηρίων. Ωστόσο, ένας κυτταρομετρητής ροής
αυξάνει το κόστος επεξεργασίας, λαμβάνοντας υπόψη ειδικά ότι δεν είναι δυνατόν
όλα τα εργαστήρια που έχουν κυτταρομετρητές να επεξεργάζονται παθογόνα όπως το
Μ. Tuberculosis.
Η ανακάλυψη της πράσινης
φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) έχει φέρει επανάσταση στη μελέτη των αλληλεπιδράσεων
ξενιστή-παθογόνου παρέχοντας ποικίλα πλεονεκτήματα. Οι φορείς της έκφρασης της
φθορίζουσας πρωτεΐνης έχουν επίσης διευκολύνει την αξιολόγηση της γονιδιακής
ρύθμισης εντός ενός κυττάρου του ξενιστή με δοκιμές προσδιορισμών
προσβεβλημένων κυττάρων. Για παράδειγμα, μια μελέτη που χρησιμοποιεί το
πλασμίδιο pLL192 περιελαμβάνει το σχεδιασμό φορέων ως εκκινητές για την έκφραση
διαφορετικών πρωτεϊνών Μ. tuberculosis που σχετίζονται με γονίδια αναφοράς GFP
(hsp60) ─ ένα γονίδιο
αναφοράς είναι ένα γονίδιο στο οποίο οι ερευνητές συνδέουν μια ρυθμιστική αλληλουχία ενός άλλου γονιδίου
που τους ενδιαφέρει σε βακτήρια , κυτταροκαλλιέργεια, ζώα ή φυτά. Χρησιμοποιούνται συχνά ως ένδειξη του κατά πόσο ένα
συγκεκριμένο γονίδιο έχει ληφθεί από ή εκφράζεται στον πληθυσμό κυττάρων ή
οργανισμών ─ και ανθεκτικότητας στην καναμυκίνης (kan) που βρέθηκαν σε Ε. coli και ηλεκτροδιατρήθηκαν (προσωρινή
απώλεια της ημιπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών, οδηγώντας έτσι σε διαρροή
ιόντων, διαφυγή μεταβολιτών και αυξημένη πρόσληψη από τα κύτταρα φαρμάκων,
μοριακών ανιχνευτών και DNA) σε Mycobacterium bovis BCG και Μ.
Tuberculosis. Τα κυψελιδικά μακροφάγα ποντικών που έχουν μολυνθεί με
επιμολυσμένα βακτηρίδια πλύθηκαν και κατεργάστηκαν με καναμυκίνη για να
εξοντώσουν τα υπόλοιπα εξωκυττάρια βακτήρια ή εκείνα που ήταν συνδεδεμένα στην
επιφάνειά τους. Τα κύτταρα λύθηκαν με ένα διάλυμα και μια ποσότητα δείγματος
σπάρθηκε σε μέσο Middlebrook 7Η10 με αντιβιοτικά για τη μέτρηση του αριθμό CFU.
Η ανάλυση των βακτηρίων με κυτταρομετρία ροής αποκάλυψε μεγαλύτερο φθορισμό σε
εκείνες τις πρωτεΐνες που υπερεκφράζονται όταν τα βακτήρια υποβάλλονται σε
στρες εντός των μακροφάγων, θεωρώντας ότι είναι γονίδια που έχουν επαγόμενη
έκφραση στα μυκοβακτηρίδια (το mceA1 είναι ένα από αυτά).
Φθοριοσιμετρική μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των
ενδοκυτταρικών παθογόνων
Μια νέα φθοριοσιμετρική μέθοδος
μέτρησης της β-λακταμάσης με βάση την κυτταρομετρία για τον ποσοτικό
προσδιορισμό των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από παθογόνα και η διαφοροποίηση
των ενδοκυττάριων από τα εξωκυττάρια βακτήρια έχει σχεδιαστεί με επιτυχία για
την ανίχνευση της ρήξης ενδοκυττάριων κενοτοπίων με M. tuberculosis.
Η μόλυνση των επεξεργασμένων
μακροφάγων γίνεται με μυκοβακτηρίδια που εκφράζουν β-λακταμάση και
διαχωρίζονται με υπερήχους, φιλτράρονται και τοποθετούνται σε κύτταρα. Στα
μολυσμένα κύτταρα προστίθεται CCF4-AM που εκπέμπει στα 535 nm (πράσινο). Η
β-λακταμάση πάνω στην μυκοβακτηριδιακή επιφάνεια είναι σε θέση να διασπάσει το
υπόστρωμα CCF4-ΑΜ μόλις συμβεί η ρήξη του φαγοσώματος, μετατρέποντας τα κύτταρα
σε μπλε (ανάγνωση στα 450 nm), όπου τα μη προσβεβλημένα είναι πράσινα. Τα
κύτταρα δεν μεταβλήθηκαν σε μια δοκιμασία με Mycobacterium bovis BCG (ένα μη
λοιμογόνο στέλεχος) επειδή βρίσκεται μόνο μέσα στο διαμέρισμα των φαγοσωμάτων.
Τα δείγματα θα πρέπει να μικροσκοπούνται, επιτρέποντας την αυτόματη βαθμολόγηση
σήματος φθορισμού για κάθε κύτταρο.
Αυτή είναι μια πολύ ακριβή
μέθοδος λόγω του υψηλού κόστους του υποστρώματος CCF4-AM και του εξοπλισμού
μέτρησης, αν και είναι χρήσιμη όσον αφορά την ανάλυση σε πραγματικό χρόνο και
τη γνώση της αλληλεπίδρασης ξενιστή-παθογόνου από την άποψη της ποσοτικής
μέτρησης. Δεν παρέχει πληροφορίες σχετικά με την ποσότητα των μυκοβακτηριδίων
που μόλυναν κάθε κύτταρο. Μπορεί να δείξει μόνο πόσα κύτταρα έχουν μολυνθεί και
έχει τα μειονεκτήματα που συνεπάγεται η χρήση μικροσκοπίου. Τα φθορίζοντα
μυκοβακτηρίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποσοτική μέτρηση που προσδιορίζει
την ποσότητα των ενδοκυττάριων βακτηρίων. Εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος
από αυτά που αναφέρθηκαν προηγουμένως και μπορούν να αναλυθούν με κυτταρομετρία
ροής.
Μελέτες που περιλαμβάνουν σήμερα
φθοριοσιμετρική ανάλυση για την ποσοτικοποίηση βακτηρίων έχουν γίνει με
βακτήρια και μυκοβακτηρίδια που εκφράζουν διαφορετικές φθορίζουσες πρωτεΐνες.
Για παράδειγμα μια μεθοδολογία έχει επίσης προταθεί για τον ποσοτικό
προσδιορισμό των ενδοκυττάριων μυκοβακτηριδίων με το M. tuberculosis να
εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη για μαζική μέτρηση με αυτοματοποιημένη
μικροσκόπηση.
ΤΟ ΠΑΡΟΝ ΚΑΙ ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ
ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ
Οι πρόοδοι που έγιναν μέχρι
σήμερα όσον αφορά την ανάπτυξη ποσοτικών τεχνικών για ενδοκυττάρια παθογόνα, η
τάση για ανάλυση με βάση το φθορισμό και οι περιορισμοί κάθε τεχνικής
υπογραμμίζουν την ύψιστη σημασία της συνεχούς διερεύνησης διαφορετικών τεχνικών
για την ποσοτικοποίηση ενδοκυτταρικών μικροοργανισμών. Αυτά θα πρέπει να επικεντρωθούν
ιδιαίτερα στην ποσοτικοποίηση του M.
tuberculosis με μεθοδολογίες που να επιτρέπουν τη διαφοροποίηση των
εξωκυττάριων μυκοβακτηριδίων από αυτά που δεσμεύονται στην επιφάνεια του
κυττάρου στόχου, υπερνικώντας τον αδυναμία της μέτρησης του αριθμού των CFU για
έναν μικροοργανισμό που σχηματίζει συσσωματώματα που έχει παρατεταμένο χρόνο
ανάπτυξης και αποφεύγοντας τον περιορισμό της σημασίας που έχει ένα δείγμα που
αναλύεται έμμεσα με τις τεχνικές που περιλαμβάνουν τη χρήση ενός μικροσκοπίου
φθορισμού. Η ανάπτυξη τεχνικών ταχέος διαγνωστικού ελέγχου με βάση τη μέτρηση
του φθορισμού, την απενεργοποίησή του ή και τα δύο είναι το παρόν και το μέλλον
για την αποτελεσματική ποσοτικοποίηση και διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων
παθογόνων. Είναι χρήσιμες στην ανάπτυξη φαρμάκων, εμβολίων και μεθόδων
διάγνωσης χαμηλού κόστους τόσο χρονικά όσο και οικονομικά.