ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΛΟΙΜΟΓΟΝΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΦΑΙΝΟΤΥΠΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ ΦΑΡΜΑΚΑ, ΤΩΝ ΜΥΚΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ IN VIVO

Μ. ΓΙΑΝΝΑΚΑΚΗ, Σ. ΚΑΡΑΜΠΕΛΑ, Ε.Δ. ΒΟΓΙΑΤΖΑΚΗΣ

Το Mycobacterium tuberculosis είναι ένα επιτυχημένο ανθρώπινο παθογόνο εξαιτίας δύο βασικών χαρακτηριστικών:

(i) χρησιμοποιεί το ευρύ φάσμα των μεταβολικών μονοπατιών του για να αναπτυχθεί, να επιβιώσει ή να παραμείνει σε πολύ διαφορετικές κυτταρικές και ανατομικές περιοχές λοίμωξης και

(ii) είναι σε θέση να παράγει μια πληθώρα μορίων με τα οποία αμύνεται και ελέγχει επιλεκτικά την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή

Αυτά τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του μυκοβακτηριδίου καθορίζουν τις αλληλεπιδράσεις κλειδί ξενιστή-παθογόνου και επίσης ελέγχουν την αντοχή στα φάρμακα. Οι ισχυρές συσχετίσεις μεταξύ γονότυπου και φαινοτύπου επιτρέπουν συχνά τη χρήση της γενετικής πληροφορίας για την αξιόπιστη πρόβλεψη και διάγνωση του φαινοτύπου (π.χ. διάγνωση της ευαίσθητης στην ριφαμπικίνη φυματίωσης με την μέθοδο Xpert MTB / RIF). Ωστόσο, υπάρχουν κλινικά σημαντικές καταστάσεις όπου η σύνδεση του γονότυπου με τον φαινότυπο είναι ασθενής ή ανύπαρκτη. Για παράδειγμα, αν και μεταλλάξεις στο γονίδιο pncA οδηγούν σε αντοχή στην πυραζιναμίδη στο M. tuberculosis, η συσχέτιση πολλών γνωστών μεταλλάξεων με την αντοχή στην  πυραζιναμίδη, είναι δύσκολο να καθοριστεί και να παρακολουθηθεί σε κλινική βάση [1]. Επιπλέον, πολλοί φαινότυποι που σχετίζονται με λοιμογονικότητα, όπως η γενετική απόκριση στην βακτηριακή πληθυσμιακή πυκνότητα  ή η ανάπτυξη βιοφίλμ, δεν μπορούν να προσδιοριστούν από την γενετική αλληλουχία  και παρ' όλο που η αλληλούχιση του RNA μπορεί να διευκολύνει τη σύνδεση του φαινοτύπου με το εκφραζόμενο γονιδίωμα στις συνθήκες αυτές, η χρήση τέτοιων προσεγγίσεων στην κλινική διάγνωση λοιμωδών νόσων θέτει πολλές προκλήσεις και χρειάζεται περαιτέρω εξέλιξη.

Κλασικά, πολλές καθιερωμένες μικροβιολογικές εξετάσεις χρησιμοποιούν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των καλλιεργειών που αναπτύσσονται από δείγματα ασθενών, για την ταυτοποίηση των ειδών ή των ευαισθησιών τους στα αντιβιοτικά ελέγχοντας την βακτηριακή ανάπτυξη και βιοχημικούς υποκατάστατους δείκτες, όπως για παράδειγμα ο μεταβολισμός. Ωστόσο, το να ληφθεί καλλιέργεια μπορεί να είναι δυσεπίτευκτο είτε εξαιτίας δυσκολιών στην πρόσβαση ή στον προσδιορισμό της περιοχής της λοίμωξης, ή  γιατί τα  βακτηρίδια των δειγμάτων μπορεί να είναι μεν ζωντανά αλλά σε μη καλλιεργήσιμη  κατάσταση, ή να απαιτούνται ιδιαίτερες συνθήκες καλλιέργειας ή ακόμη λόγω βραδείας ανάπτυξης. Επιπλέον, εξαιτίας ριζικών διαφορών μεταξύ του εχθρικού περιβάλλοντος του ξενιστή και του πιο «ανεκτικού»  περιβάλλοντος της καλλιέργειας, φαινοτυπικά χαρακτηριστικά σημαντικά στη σχέση ξενιστή-παθογόνου μπορεί να μην εκφράζονται στην καλλιέργεια. Ως εκ τούτου, οι πληροφορίες από τη βακτηριδιακή καλλιέργεια δεν αποδίδουν επακριβώς το τι συμβαίνει στον ξενιστή και αρκετά  σημαντικά  φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η αντοχή στα φάρμακα, χρειάζεται να μελετώνται in situ στον ξενιστή για να αποκτηθούν γνώσεις σχετικά με την αλληλεπίδραση ξενιστή-παθογόνου και για να καταστεί δυνατή η γρήγορη διάγνωση της παρουσίας βακτηρίων, η ταυτοποίησής τους ή η ευαισθησία τους στα φάρμακα.

ΙΧΝΗΘΕΤΕΣ ΣΤΑΘΕΡΩΝ ΙΣΟΤΟΠΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ IN SITU ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΦΑΙΝΟΤΥΠΩΝ

  Η ιδέα είναι απλή: ιχνηθέτες επισημασμένοι με  σταθερά ισότοπα μπορούν να εισέλθουν σε συγκεκριμένο σημείο του βακτηριακού μεταβολισμού και τα σημασμένα προϊόντα του, αναλύονται (π.χ. στην αναπνοή) για να αποκαλύψουν βακτηριακούς μεταβολικούς  φαινότυπους. Η ενζυματική φύση των αντιδρασεων επιτρέπει την ταχεία ενίσχυση του σήματος σε ανιχνεύσιμα επίπεδα. Αρχέτυπο των προσεγγίσεων αυτών αποτελεί το τεστ αναπνοής για το  Helicobacter pylori με την χρήση επισημασμένης με ¹³C-urea, η κατάποσης της οποίας οδηγεί τον ιχνηθέτη στο σημείο της λοίμωξης (στομάχι), όπου το ένζυμο urease του H. pylori, μετατρέπει την ¹³C-urea σε  ¹³CO₂  που αποβάλλεται με την αναπνοή.

Τα παθογόνα του πνεύμονα θεωρητικά θα μπορούσαν να ανιχνευτούν και μελετηθούν με ένα παρόμοιο τρόπο. Η διοχέτευση του ιχνηθέτη είτε μέσω νεφελοποίησης ή με αναπνοή ξηράς  σκόνης θα μπορούσε να ελέγξει ειδικά τους πνεύμονες με πρώιμη δειγματοληψία από την εκπνοή, αποκλείοντας τις παρεμβολές της σύνθετης μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου. To M. tuberculosis έχει ήδη δοκιμαστεί, μιας και είναι ένα βακτηριακό παθογόνο που εκφράζει τον λοιμογονικό παράγοντα urease [3, 4], ένα ένζυμο που παραδοσιακά χρησιμοποιείται για την φαινοτυπική ταυτοποίηση καλλιεργειών [5]. Η απευθείας διοχέτευση, του ιχνηθέτη, στους πνεύμονες ζωικού μοντέλου φυματίωσης – κουνελιού-  έδειξε ότι ήταν δυνατή η διάκριση μεταξύ ασθενών και υγειών ζώων αμέσως μετά την  χορήγηση [6]. Επιπρόσθετα, τα επίπεδα του ¹³CO₂  συσχετίζονταν με το βακτηριακό φορτίο κατά την διάρκεια της θεραπείας ή μετά την διακοπή της, υποδηλώνοντας ότι η αρχική αποτελεσματικότητα ενός σχήματος (και κατά συνέπεια η ευαισθησία στα φάρμακα) θα μπορούσε γρήγορα και απλά να καθοριστεί με ένα τρόπο ανάλογο των αρχικών μελετών για την βακτηριοκτόνο δράση των φαρμάκων [6].  Ωστόσο, η urease εκφράζεται από ευρύ φάσμα παθογόνων του πνεύμονα και ως εκ τούτου, παρότι επιτρέπει την ανίχνευση της παρουσίας ευρέως φάσματος βακτηριδίων και την παρακολούθηση της ανταπόκρισης στην θεραπεία, η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους απαιτεί επιπρόσθετες προσεγγίσεις. Αυτό οδήγησε στην μελέτη πιο ειδικών μεταβολικών μονοπατιών , ώστε να καταστεί δυνατή η με μεγάλη ακρίβεια ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους. Ένα τέτοιο μονοπάτι που φαίνεται ότι είναι πολύ ειδικό για τα μυκοβακτήρια είναι αυτό της CO dehydrogenase (CODH) που οξειδώνει το CO σε CO₂. Επιπρόσθετα το CO έχει δειχθεί ότι έχει πολύ ισχυρή επίδραση στην γενετική έκφραση και τον φαινότυπο των μυκοβακτηριδίων [7,8] και έτσι η CODH μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση παθογόνου-ξενιστή ρυθμίζοντας τα επίπεδα CO. Η χρησιμοποίηση διπλά επισημασμένου ¹³C¹⁸O που μετατρέπεται από την CODH σε  ¹³C¹⁸O¹⁶O  επέτρεψε την αποτελεσματική διάκριση μολυσμένων και μη ζώων. [9]. Η φαρμακολογική καταστολή του ενζύμου carbonic anhydrase , που μετατρέπει το CO₂ HCO₃^-  επέτρεψε την διατήρηση σημαντικής συγκέντρωσης ¹³C¹⁸O¹⁶O . Πάντως, η κλινική χρήση της μεθόδου θα ήταν περιορισμένη λόγω της δόσης CO που θα απαιτείτο. Αν και η χρήση μικρής δόσης  ¹⁴CO και η ανίχνευση του παραγόμενου ¹⁴CO₂  με επιταχυντή και φασματογράφο μάζας, θα μπορούσε να ξεπεράσει αυτούς τους περιορισμούς, κάτι τέτοιο θα ήταν μάλλον απίθανο να χρησιμοποιηθεί σε περιοχές με περιορισμένα μέσα 

Ένας βασικό κλινικό φαινοτυπικό χαρακτηριστικό, είναι η ευαισθησία στα φάρμακα και πολλά βασικά αντιβιοτικά για τη φυματίωση είναι προφάρμακα που μετατρέπονται από μυκοβακτηριδιακά ένζυμα στην ενεργή μορφή τους. Μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν για  τέτοια ένζυμα και οι οποίες εμποδίζουν την ενεργοποίηση του προφάρμακου συχνά οδηγούν σε υψηλά επίπεδα αντοχής. Η δοκιμασία αναπνοής ισοτόπων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της ενεργοποίησης του προφάρμακο,  επειδή αυτή περιλαμβάνει οξειδωτικούς ή υδρολυτικούς μηχανισμούς με αποτέλεσμα τον σχηματισμό πτητικών προϊόντων που μπορούν να ανιχνευθούν στην αναπνοή. Στην περίπτωση της ισονιαζίδης (INH), η οξειδωτική ενεργοποίηση από το μυκοβακτηριδιακό ένζυμο KatG καταλήγει στο σχηματισμό ριζών ισονικοτινυλακυλίου το οποίο  σχηματίζει ενώσεις προσθήκης με NADH και NADPH , οι οποίες και αποτελούν ισχυρούς αναστολείς της σύνθεσης του μυκολικού οξέος [10]. Ο σχηματισμός αυτής της ρίζας θεωρείται ότι περιλαμβάνει τη διάσπαση μιας πρόδρομης ρίζας υδραζιδίου και την απελευθέρωση HN=NH, ασταθούς διαζένιου,   που διασπάται και σχηματίζει Ν₂ [11,12]. Με σήμανση του υδραζιδίου της ισονιαζίδης (INH) με ¹⁵Ν, επιδιώχθηκε η ανίχνευση της οξειδωτικής ενεργοποίησης της INH από το KatG με το προϊόν ¹⁵Ν₂ που θα προέκυπτε. Οι in vitro μελέτες έδειξαν ειδικότητα όσον αφορά το είδος - M. tuberculosis - σε σύγκριση με κάποια κοινά παθογόνα του αναπνευστικού και ήταν δυνατό να γίνει διάκριση μεταξύ ενός ευαίσθητου στο φάρμακο και ενός ανθεκτικού, μεταλλαγμένου KatG S315T, στελέχους, το οποίο εμφανίζει μειωμένη ενεργοποίηση της INH [11].

In all cases, only active disease was studied, and it is unclear what lower bacterial burdens (such as in latent or pre-clinical disease) these techniques might be sensitive enough to detect subclinical or asymptomatic infections. Similarly, mixed resistant/sensitive populations might prove difficult unless one dominates, as will occur for the resistant phenotype upon treatment.

Μελέτες στο μοντέλο του κουνελιού έδειξαν την ικανότητα γρήγορης διάκρισης των ζώων με λοίμωξη από τα ζώα ελέγχου (εντός 5 λεπτών μετά την διέλευση από τους πνεύμονες) και φαίνεται ότι υπήρχε συσχέτιση της έντασης του σήματος του ¹⁵Ν₂ με το βακτηριακό φορτίο [11]. Σε όλες τις περιπτώσεις μελετήθηκε μόνο η ενεργός νόσος και δεν είναι σαφές ποια είναι τα χαμηλότερα βακτηριακά φορτία (όπως στη λανθάνουσα ή προκλινική ασθένεια) που αυτές οι τεχνικές θα ήταν αρκετά ευαίσθητες να ανιχνεύσουν στις υποκλινικές ή ασυμπτωματικές λοιμώξεις. Ομοίως, οι μικτοί ανθεκτικοί / ευαίσθητοι πληθυσμοί μπορεί να αποδειχθούν δύσκολοι στην ανίχνευση, εκτός αν κάποιος κυριαρχήσει, όπως συμβαίνει για τον ανθεκτικό φαινότυπο  στη πορεία της θεραπείας.

Υπάρχουν σε εξέλιξη προκλινικές μελέτες για τεστ αναπνοής και για άλλα προφάρμακα, που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στην αποτροπή της ανάπτυξης αντοχής, όπως για παράδειγμα κατά το σχήμα  PaMZ (pretomanid moxifloxacin και pyrazinamide). Επίσης, άλλα, εκτός της φυματίωσης, αντίστοιχα ερευνητικά προγράμματα που είναι σε εξέλιξη, περιλαμβάνουν τεστ αναπνοής για την πνευμονική λοίμωξη από Francisella tularensis,  μέσω ανάλυσης του  ¹³CO₂  που προέρχεται από την ¹³C-citrulline με την δράση του παράγοντα citrulline ureidase και η ανίχνευση του Clostridium difficile μέσω του  ¹³CO₂ που απελευθερώνεται κατά την διαδικασία παραγωγής  p-cresol .

 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Είναι μια εξαιρετικά ενδιαφέρουσα εξέλιξη, το ότι με την χρησιμοποίηση ισοτοπικών τεστ αναπνοής μπορούμε να ελέγξουμε  in situ βακτηριακά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων εξαιρετικά σημαντικών όπως η φαρμακευτική αντοχή. Η γνώση που έχει συσσωρευθεί μπορεί να βοηθήσει στην πιο γενικευμένη εφαρμογή αυτής της προσέγγισης για την κατανόηση του ρόλου των πολύπλοκών και ποικίλων  βακτηριακών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών  που εμπλέκονται στον έλεγχο της ομοιόστασης τόσο του παθογόνου όσο και του ξενιστή στην ασυπτωματική και συμπτωματική λοίμωξη.

References

1. Sandgren A, et al. Tuberculosis Drug Resistance Mutation Database. Plos Med. 2009;6:132–136.

2. Van Keuren-Jensen K, et al. Bringing RNA-seq closer to the clinic. Nature Biotechnology. 2014;32:884–885. [PubMed]

3. Lin W, et al. Urease activity represents an alternative pathway for Mycobacterium tuberculosis nitrogen metabolism. Infect Immun. 2012;80:2771–2779. [PMC free article] [PubMed]