Κιούση Θεοπούλα, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων.
Οι χρώσεις των μικροβίων που χρησιμοποιούνται στα μικροβιολογικά εργαστήρια χωρίζονται σε: απλές (κυανό του μεθυλενίου), σύνθετες (Gram, Ziehl-Neelsen), ειδικές (Albert, Neisser, Loeffler, Gomori, Κυανό της τολουιδίνης, σινική μελάνη) και χρώσεις με φθοριοχρώματα (αουραμίνης-ροδαμίνης, Calcofluor-white, Acridine Orange).
Οι συνήθεις σύνθετες χρώσεις που πραγματοποιούνται σε καθημερινή
βάση στο εργαστήριο μας είναι:
· χρώση κατά Gram
· χρώση κατά Zielh – Neelsen
· χρώση κατά Giemsa.
Οι σύνθετες χρώσεις περιέχουν: μία κύρια χρωστική, σταθεροποιητή, αποχρωματιστική ουσία (αιθανόλη, ακετόνη) και μία χρώση με αντιθέτου χρώματος χρωστική
ΧΡΩΣΗ ΚΑΤΑ GRAM
Επινοήθηκε το 1884 από τον Hans Christian Gram (1853-1938). Είναι μια σύνθετη θετική χρώση που χρησιμοποιείται περισσότερο στη μικροβιολογία. Η περιγραφή κάθε είδους μικροβίου αρχίζει πάντοτε με τον τρόπο που χρωματίζεται με τη χρώση Gram, δηλ. αναφέρεται ως Gram θετικό ή Gram αρνητικό βακτήριο. Αυτό οφείλεται στη διαφορετική δομή του κυτταρικού τοιχώματος αυτών, που ρυθμίζει τη διαπερατότητα στους οργανικούς διαλύτες.
Έτσι έχουμε τα Gram θετικά που κατακρατούν την πρώτη χρωστική να εμφανίζονται με χρώμα κυανό, ενώ τα Gram αρνητικά που αποχρωματίζονται με τον οργανικό διαλύτη να χρωματίζονται κόκκινα από τη δεύτερη χρωστική. Είναι μια εμπειρική μέθοδος που έχει υποστεί τροποποιήσεις. Η τεχνική που χρησιμοποιούμε ακολουθεί τα εξής βήματα:
· κάλυψη του παρασκευάσματος με υδατικό διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (1’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· κάλυψη του παρασκευάσματος με διάλυμα ιωδίου (Lugol) (1’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· αποχρωματισμός με διάλυμα αιθανόλης ακετόνης (1:1) (<10’’)
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· μεταχρωματισμός με υδατικό διάλυμα σαφρανίνης (1’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· στέγνωμα
· μικροσκόπηση
Απαραίτητη είναι η παρατήρηση πολλών οπτικών πεδίων (>20).Στην απάντηση της μικροσκόπησης δεν δίνουμε τους μικροοργανισμούς με το είδος και το γένος, αλλά μόνο περιγραφικά.
Προσοχή:
· Σημαντικό σημείο στην επιτυχία της διαδικασίας είναι ο χρόνος που αφήνεται να δράσει το αποχρωματιστικό, γιατί παρατεταμένος χρόνος θα αποχρωματίσει και τα Gram θετικά που θα χρωματιστούν αργότερα κόκκινα, ενώ λιγότερος δεν θα αποχρωματίσει τα Gram αρνητικά τα οποία θα μείνουνε μπλε.
· Χρειάζεται σωστή τεχνική και ποιοτικός έλεγχος .
· Τα χαρακτηριστικά των βακτηρίων επηρεάζονται από: ηλικία του
καλλιεργήματος , από το καλλιεργητικό υλικό, ατμόσφαιρα επώασης, παρουσία
ανασταλτικών παραγόντων και παρουσία φαγοκυττάρων.
· Υπάρχουν πληθυσμοί θετικών κατά Gram βακτηρίων που χρωματίζονται
αρνητικά κατά Gram
· Σε παλιά καλλιεργήματα μερικά θετικά κατά Gram βακτήρια παρουσιάζουν αυξημένο αριθμό αρνητικών κατά Gram κυττάρων (Bacillus sp, Clostridium sp)
· Gram variable: Actinomyces sp, Arthobacter sp, Bacillus sp, Butyrvibrio sp,Clostiridium sp, Corynebacterium sp, Mycobacterium sp, Propionobacterium sp
· Δύκολα χρωματιζόμενα: Borellia sp, Mycoplasma sp
· Μη χρωματιζόμενα: Τreponema palidum
· Μπορούν να χρωματιστούν με Gram χρώση:κύστεις Pneumocystis carinii, τριχομονάδες, Strongyloides sp, τροφοζωίτες Toxoplasma gondii
ΧΡΩΣΗ ΚΑΤΑ ZIELH-NEELSEN
Επινοήθηκε το 1882 από τους Franz Zielh (1859-1926) και Friedrich Neelsen (1854-1894). Είναι μια σύνθετη θετική χρώση για οξεάντοχους μικροοργανισμούς (Mycobacterium, Nocardia, Actinomykes, ωοκύστεις Cryptosporidium, Isospora belli). Οξεαντοχή είναι η φυσική ιδιότητα μερικών μικροοργανισμών που αναφέρεται στην ανθεκτικότητά τους να μην αποχρωματίζονται κατά τη διαδικασία της χρώσης κατόπιν επεξεργασίας με οξέα. Αποτέλεσμα αυτού είναι ορισμένα μικρόβια που έχουν υψηλή περιεκτικότητα κυτταρικού τοιχώματος σε μυκολικό οξύ, όταν η ουσία αυτή χρωματιστεί εν θερμό με μια ισχυρή βασική χρωστική να σχηματίζει ένωση που δεν αποχρωματίζεται με οξέα. Έτσι τα μικρόβια εμφανίζονται έντονα κόκκινα. Αφού προηγηθεί μονιμοποίηση του παρασκευάσματός μας σε θερμοτράπεζα, η τεχνική της χρώσης που ακολουθούμε είναι η εξής:
· κάλυψη του παρασκευάσματος με πυκνή φαινικούχο φουξίνη (5’ )
· θέρμανση της κάτω επιφάνειας του παρασκευάσματος με φλόγα μέχρι να
εμφανιστούν ατμοί (5’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· αποχρωματισμός με οξυνισμένη αλκοόλη (1’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· μεταχρωματισμός με κυανούν του μεθυλενίου (30-60’’)
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· στέγνωμα
· μικροσκόπηση
Για τη μικροσκόπιση της Zielh-Neelsen απαιτούνται τουλάχιστον 100 έως 300 οπτικά πεδία.
Προσοχή:
· Σημαντικό σημείο για την επιτυχία της διαδικασίας είναι η διήθηση της φαινικούχου φουξίνης, για την αποφυγή ιζημάτων που μπορεί να μπερδέψουν το μικροσκόπο.
ΧΡΩΣΗ MAY GRUNWALD – GIEMSA
Χρησιμοποιείται κυρίως για τα επιχρίσματα αίματος και μυελού των οστών καθώς αλλά και για τα στείρα βιολογικά υλικά (πλευριτικό υγρό, περικαρδιακό υγρό, ασκιτικό, υγρό, αρθρικό υγρό, εγκεφαλονωτιαίο υγρό) για το χαρακτηρισμού του τύπου των λευκών. Χαρακτηρίζεται ως πανοπτική χρώση, επειδή βάφει όλα τα κυτταρικά συστατικά. Έτσι έχουμε μπλε το RNA, το κυτταρόπλασμα και τους πυρινίσκους, κόκκινα και μωβ το DNA και τα πρωτογενή κοκκία, πορτοκαλί και κόκκινα την αιμογλοβίνη και τα εωσινοφιλικά κοκκία. Η τεχνική της χρώσης είναι η εξής:
· κάλυψη του παρασκευάσματος με May Grunwald (5’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· κάλυψη με αραιωμένο διάλυμα Giemsa (20’ )
· ξέπλυμα με νερό βρύσης
· στέγνωμα
· μικροσκόπηση
Εξετάζουμε εκατό (100) λευκοκύτταρα και τα κατατάσσουμε ανάλογα με τον τύπο τους σε πολυμορφοπύρηνα, λεμφοκύτταρα, βασεόφιλα, εωσινόφιλα, μονοκύτταρα.
Προσοχή:
· Πολύ σημαντική για τις ιδιότητες της χρώσης είναι η τιμή του ph και οποιαδήποτε αλλαγή του θα οδηγήσει σε λανθασμένη αντίδραση της χρώσης. Τα όρια βέλτιστου ph είναι 6,5 – 6,8.
(www.routsias-lab.gr/files/Download/Χρώσεις%20μικροβίων.
el.wikipedia.org/wiki
1epal-mesol.ait.sch.gr/autosch/joomla15/MikrobiologiaI.
www.bmlabs-mag.gr )