Μοριακή διάγνωση φυματίωσης και γονοτυπικός έλεγχος αντοχής στα αντιφυματικά φάρμακα

Π. Ιωαννίδης,

Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων (ΕΚΑΜ), 

Μικροβιολογικο Εργαστήριο, Νοσοκομείο "Σωτηρία"

Στις αρχές του 21^ου αιώνα η φυματίωση παραμένει ένα από τα κυριότερα λοιμώδη νοσήματα. Το 2012 υπήρχαν  παγκοσμίως 8,6 εκατομμύρια νέα περιστατικά και  ~1,3 εκατομμύρια θύματα, με συνέπεια η φυματίωση να αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου από μολυσματικό νόσημα, μετά το AIDS [1].   Περίπου το 1/3 του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί από τον βάκιλο  Μycobacterium tuberculosis (MΤΒ),  που παραμένει όμως στην συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων υπό τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήματος (λανθάνουσα νόσος). Ο βάκιλος  μπορεί να ενεργοποιηθεί και να οδηγήσει σε ενεργό νόσο, με την πτώση του ανοσοποιητικού συστήματος και αυτό μπορεί να συμβεί φυσιολογικά με την γήρανση ή λόγω παθολογικών καταστάσεων όπως  η ΗΙV λοίμωξη, ορισμένες κακοήθειες, ο διαβήτης ή αλλά παθολογικά αίτια, αλλά και εξ' αιτίας παραγόντων που υποβαθμίζουν το επίπεδο ζωής. Ιστορικά η φυματίωση έχει συνδεθεί με την φτώχεια, και κατά  συνέπεια , η τρέχουσα οικονομική κρίση, ενέχει κινδύνους αναζωπύρωσης της, ακόμη και σε χώρες ή περιοχές με χαμηλό  επιπολασμό της νόσου [2].  Στην χώρα μας, τα επίσημα στοιχεία, με βάση τα καταγεγραμμένα κρούσματα, δείχνουν χαμηλό επιπολασμό της νόσου. Όμως αυτό δεν πρέπει να αποτελεί στοιχείο εφησυχασμού,  γιατί: α) υπάρχει,  σημαντικό ποσοστό υποδήλωσης, που εκτιμάται ότι μπορεί να αγγίζει ακόμη και το 80% [3], β) γιατί υπάρχουν ήδη καταγεγραμμένα ανησυχητικά  δεδομένα για τις  επιπτώσεις της οικονομικής κρίσης σε άλλα νοσήματα, όπως η λοίμωξη από τον ιό HIV [4] και γ) η χώρα αποτελεί πύλη εισόδου προς την Ε.Ε. μεταναστών από περιοχές με υψηλό επιπολασμό της νόσου.   

            Σημαντικό πρόβλημα για την αντιμετώπιση της νόσου αποτελεί η ανάδειξη και διασπορά πολυανθεκτικών (MDR-TB: αντοχή στα κυρία αντιφυματικά φάρμακα ριφαμπικίνη και ισονιαζίδη) και υπερ-ανθεκτικών (XDR-TB:  με επιπρόσθετη αντοχή και στα δευτερεύοντα αντιφυματικά κινολόνες και  αμινογλυκοσίδες/κυκλικά πεπτίδια) στελεχών του βακίλου.   Οι μορφές αυτές της νόσου αποτελούν ιδιαίτερη πρόκληση για το σύστημα υγείας, λόγω της υψηλού  κόστους μακροχρόνιας θεραπείας, την ανάγκη νοσηλείας σε ειδικές συνθήκες (ατομικούς θαλάμους αρνητικής πίεσης), αλλά και την ίδια την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, ιδιαίτερα για ασθενείς με XDR-TB. Η αντοχή του βακίλου της φυματίωσης, οφείλεται σε χρωμοσωμικές μεταλλάξεις σε διαφορετικούς γενετικούς τόπους,  για τα διάφορα φάρμακα. Οι μεταλλάξεις αυτές, που συμβαίνουν τυχαία, επιλέγονται και συσσωρεύονται, λόγω ελλιπούς αγωγής ή μη συμμόρφωσης στην θεραπευτική αγωγή, που είναι πολυφαρμακευτική και πολύμηνη και απαιτεί συνεχή ιατρική/νοσηλευτική  παρακολούθηση για την πιστή τήρηση της . Η έξαρση της εμφάνισης τέτοιων μορφών της νόσου παρατηρείται σε χώρες που αντιμετώπισαν ή αντιμετωπίζουν σημαντικά προβλήματα στο υγειονομικό τους σύστημα.  Αρχικά υπήρχε η εκτίμηση ότι οι μεταλλάξεις που συνδέονται με αντοχή μειώνουν το προσαρμοστικότητα (fitness)  των στελεχών και ως εκ τούτου τη μολυσματικότητα και την διασπορά τους. Σήμερα, όμως είναι σαφές ότι συγκεκριμένες μεταλλάξεις ή συνδυασμοί τους δεν μειώνουν την προσαρμοστικότητα  λόγω εμφάνισης και επιλογής αντισταθμιστικών μεταλλάξεων [5].

             

            Η εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης στηρίζεται σε συνδυασμό διαφορετικών μεθοδολογιών, που αναπτύσσονται σε βάθος χρόνου μιας  και η ανάπτυξη του βακίλου στην καλλιέργεια, μπορεί να απαιτήσει έως και   40 ημέρες.  Αν μάλιστα  συνυπολογιστεί και ο   έλεγχος της φαρμακευτικής αντοχής με την μέθοδο της καλλιέργειας, το διάστημα μπορεί να φτάσει έως και τις 60 ημέρες.  Ο χρόνος αυτός είναι πολύτιμός - ιδιαίτερα σε περιπτώσεις MDR/XDR-TB - τόσο για τον ασθενή όσο και για τον έλεγχο της διασποράς της νόσου.  Το μεγάλο πλεονέκτημα των μοριακών τεχνικών είναι η ταχύτητα και η  υψηλή ευαισθησία τους, που σε συνδυασμό με την μεγάλη διαγνωστική ακρίβεια και επαναληψιμότητα, τις καθιστούν πολύτιμες για τη διάγνωση, ταυτοποίηση, αλλά  και τον έλεγχο της  ευαισθησίας του M. tuberculosis στα αντιφυματικά φάρμακα μέσω της ανίχνευσης γενετικών  μεταλλάξεων. Ο ΠΟΥ έχει πρόσφατα υιοθετήσει μια σειρά από αυτές τις διαγνωστικές προσεγγίσεις (μέθοδοι ανάστροφου υβριδισμού, Gene Xpert MTB/RIF) [6]. Ωστόσο, ακόμη και οι μέθοδοι που θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως  "παρά τη κλίνη"  προσεγγίσεις, συνιστάται να χρησιμοποιούνται ενταγμένες στον διαγνωστικό αλγόριθμο, στον οποίο η   κλασική διαγνωστική προσέγγιση με την καλλιέργεια, παραμένει η μέθοδος αναφοράς τόσο για την ανίχνευση όσο και για τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα [7].  Η εφαρμογή των μεθόδων πρέπει να γίνεται από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό με διακριβωμένο εξοπλισμό  και να εφαρμόζεται τόσο Εσωτερικός όσο και Εξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας , ο οποίος για το  ΕΚΑΜ παρέχεται από το 2010, από τον Οργανισμό Instand e.V, με άριστα αποτελέσματα,  στo πλαίσιο του Ευρωπαίκού Δικτύου Εργαστηρίων Φυματίωσης (ERLN-TB).

           

            Στην επιδημιολογική διερεύνηση της φυματίωσης, η γενετική ανάλυση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, αφού ο δημιουργία του  γενετικού αποτυπώματος των επιμέρους στελεχών παρέχει την δυνατότητα  της ομαδοποίησης τους με βάση τον βαθμό της συγγένειας τους. Η μοριακή επιδημιολογία έχει αποκαλύψει την ύπαρξη  μεγάλων οικογενειών στελεχών του ΜΤΒ, με κυρίαρχη μεν παρουσία σε συγκεκριμένες περιοχές, αλλά και παγκόσμια διασπορά από την αρχική γεωγραφική/πληθυσμιακή αφετηρία τους. Ιδιαίτερα ανησυχητική είναι η παγκόσμια διασπορά στελεχών της οικογένειας Beijing που φαίνεται να εμφανίζουν   αυξημένη μολυσματικότητα και παθογένεια, ενδογενή αντοχή σε αντιφυματικά φάρμακα και συνδέονται με επιδημίες MDR-TB  κυρίως  στις χώρες της Α. Ευρώπης και της Άπω Ανατολής. Τα MDR-TB στελέχη της οικογένειας  αυτής, ενδεχόμενα να αποτελούν μια πηγή καλά προσαρμοσμένων, ιδιαίτερα μολυσματικών και παθογόνων στελεχών, με τους αντίστοιχούς κινδύνους που αυτό συνεπάγεται [8] . Κάποια από αυτά τα στελέχη, με αφετηρία τις χώρες της Βαλτικής, εμφανίζουν πλέον ενεργή διασπορά στο σύνολο της ευρωπαϊκής ηπείρου. Επιπρόσθετα η μοριακή επιδημιολογία, στις χώρες στις οποίες είναι ενταγμένη στο σύστημα ενεργού διερεύνησης της νόσου, έχει αναδειχθεί σε σημαντικό εργαλείο για την αποκάλυψη επιδημικών εξάρσεων , την εύρεση της αλυσίδας της μετάδοσης  και την λήψη προληπτικών μέτρων, αλλά και για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των αντιφυματικών προγραμμάτων [9].

Όπως και σε άλλα πεδία, η μοριακή γενετική επαναστατικοποίησε τόσο την διάγνωσή όσο και την επιδημιολογική διερεύνηση της φυματίωση τα τελευταία 10-15 χρόνια. Η ανάπτυξή των νέων μεθοδολογιών που κάνουν πολύ εύκολη και οικονομικά προσιτή την ανάγνωση όλου του γενετικού υλικού των οργανισμών , δίνει ήδη σημαντικά δεδομένα τόσο στην αποκάλυψή της γενετικής βάσης των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του βακίλου όσο και στην λεπτομερέστερη επιδημιολογική διερεύνηση. Η εφαρμογή της στην καθ' ημέρα πράξη θα επαναστατικοποιήση περεταίρω και την  καθημερινότητα της διάγνωσης. 

  

Βιβλιογραφία

1. WHO: Global Tuberculosis Control 2013. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en

2. M J van der Werf, J Giesecke, M Sprenger "Can the economic crisis have an impact on tuberculosis in the EU/EEA ?" Eurosurveillance, (2012) v. 17, Iss. 12,

3. Lytras T, Spala G, Bonovas S, Panagiotopoulos T (2012) Evaluation of Tuberculosis Underreporting in Greece through Comparison with Anti-Tuberculosis Drug Consumption. PLoS ONE 7(11): e50033. doi:10.1371/journal.pone.0050033

4. ΚΕΕΛΠΝΟ: ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΤΗΣ HIV ΛΟΙΜΩΞΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ(ΕΩΣ 31/10/2012). http://www.keelpno.gr/el-gr

5. I. Comas, S. Borrell, A. Roetzer, G. Rose, B. Malla, M. Kato-Maeda, J. Galagan, S. Niemann & S. Gagneux "Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerase genes" Nature Genetics, 44,106–110, (2012), doi:10.1038/ng.1038

6. World Health Organization. Policy statement. Molecular line probe assay for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant (MDR) TB. Geneva, 2008.

7. Helb D, Jones M, Story E, Boehme C, Wallace E, Ho K, Kop J, Owens MR, Rodgers R, Banada P et al. (2010) Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J Clin Microbiol. 48: 229-237.

8.  European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and

Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis. Beijing/

W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance. Emerg

Infect Dis (2006), 12:736–43.

9. H. van Deutekom, P.  Supply, P. E. W. de Haas, E. Willery, S. P. Hoijng, C. Locht, R. A. Coutinho and D. van Soolingen "Molecular Typing of Mycobacterium tuberculosis by Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem Repeat Analysis, a More Accurate Method for Identifying Epidemiological Links between Patients with Tuberculosis" J Clin Microbiol. 2005,  43(9): 4473–4479.