ΓΝΩΡΙΜΙΑ ΜΕ ΤΑ Nontuberculus Mycobacteria-NTM

Τάσος Σκούρογλου
ΤΕ Ιατρικών Εργαστηρίων

Τα μυκοβακτηρίδια ανήκουν στο γένος Mycobacteria ή Mycobacterium, το οποίο είναι το μόνο γένος της οικογένειας Mycobacteriaceae,  της τάξης των Actinomycetales. Η περιεκτικότητά τους σε βάσεις G+C του DNA είναι υψηλή (61% έως 71%, εκτός του M. leprae  που είναι 55%) και εμφανίζει ομοιότητες με τα γένη, που έχουν επίσης μυκολικά οξέα στην επιφάνειά τους και υψηλή συγκέντρωση G+C και συγκεκριμένα Nocardia (64 έως 72%), Rhodococcus (63 έως 73%), Gorgonia (63 έως 69%) και Tsukamurella (68 έως 74%)».(Μαρίνης και συν.,2006)

Eίναι ποικίλου μεγέθους και σχήματος,  ασπορογόνα, ακίνητα, αερόβια βακτηρίδια, τα οποία  εμφανίζουν παχύ, πολύπλοκο  κυτταρικό τοίχωμα με πολλά λιπίδια με κυριότερο το μυκολικό οξύ που τους προσδίδει μεγάλη αντίσταση σε χημικούς και φυσικούς βλαπτικούς παράγοντες, ενισχύει τη λοιμογόνο δράση τους, τους προσδίδει μακρό χρόνο γενεάς, τα καθιστά δύσκολα στη χρώση και οξεάντοχα και ενισχύει την αντιγονικότητά τους. (Παπαβασιλείου, 1995)

Στην αρχή αυτού του αιώνα,  το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης M. tuberculosis ήταν το μόνο είδος μυκοβακτηριδίου  που απομονώθηκε από τον άνθρωπο και που συνδέθηκε με ανθρώπινη ασθένεια. Στη συνέχεια  καθώς άλλα είδη μυκοβακτηριδίου αναγνωρίστηκαν ως αιτίες κάποιας ανθρώπινης ασθένειας αυτά φέρονταν στο σύνολό τους με διάφορες ονομασίες:

·         Nontuberculus Mycobacteria-NTM (μη φυματιώδη μυκοβακτηρίδια) (έχει επικρατήσει σήμερα)

·         Bάκιλλοι MOTT» (mycobacteria other than tuberculosis, μυκοβακτηρίδια άλλα εκτός από της φυματίωσης)

·         Άτυπα μυκοβακτηρίδια

·         Καιροσκοπικά μυκοβακτηρίδια

·         Περιβαλλοντικά μυκοβακτηρίδια 

Σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότερα από 125 είδη τα οποία διαχωρίζονται:

Ø  Με βάση το ρυθμό ανάπτυξης και το χρώμα των αποικιών τους κατά την επώασή τους στο φως ή στο σκότος σε: βραδέως αναπτυσσόμενα (> από 7 ημέρες σε ανακαλλιέργειες) φωτοχρωμογόνα, σκοτοχρωμογόνα, μη φωτοχρωμογόνα και σε ταχέως αναπτυσσόμενα (< από 7 ημέρες σε ανακαλλιέργειες).

Ø  Με βάση την παθογόνο δράση τους σε: υποχρεωτικά  και ευκαιριακά παθογόνα και σε σαπρόφυτα.

Ø  Με βάση τον κίνδυνο πρόκλησης νόσου στον άνθρωπο: στην ομάδα Ι, την ομάδα ΙΙ και την ομάδα ΙΙΙ κατά αύξουσα σειρά επικινδυνότητας.

Αυτές οι διαιρέσεις δεν έχουν καμία επίσημη ταξινομική υπόσταση αλλά είναι χρήσιμες στην προσπάθεια ταυτοποίησης.  Ο συνδυασμός τους μας δίνει το πίνακα της επόμενης σελίδας, όπου φαίνονται τα είδη που συχνότερα απαντώνται και ταυτοποιούνται στις καλλιέργειες.

Η ταξινόμησή τους γίνεται με βάση την  16S rRNA αλληλουχία νουκλεοτιδίων (μια ακολουθία περίπου 1.500 νουκλεοτιδίων, η οποία κωδικοποιείται από το 16S ριβοσωμικό DNA (rDNA), ένα καλά συντηρημένο γονίδιο στο οποίο υπάρχουν περιοχές που είναι κοινές σε όλα τα έμβια όντα και περιοχές που εμφανίζουν διαφορές ανάλογα με το είδος).

Τα NTM είναι ευρέως διαδεδομένα στο περιβάλλον με υψηλά ποσοστά απομόνωσης σε όλο τον κόσμο.  Μπορούν να βρεθούν στο έδαφος και το νερό. Σύμφωνα με έρευνες παγκοσμίως, έχει βρεθεί επανειλημμένα ότι πληθυσμοί μυκοβακτηριδίων διαβιούν σε φυσικά ύδατα όπως λίμνες, ποτάμια και ρυάκια. Στο θαλασσινό νερό περιέχονται σπάνια καθώς δεν μπορούν να αναπτυχθούν σε συνθήκες υψηλής αλατότητας. Σπανίως βρίσκονται σε υπόγεια νερά, ωστόσο μεγάλοι αριθμοί μυκοβακτηριδίων υπάρχουν συνήθως σε νερά χαμηλής περιεκτικότητας σε οξυγόνο και υψηλής περιεκτικότητας σε οργανικά υλικά.

Α	Β
ΝΤΜ ΣΥΧΝΑ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΑ ΜΕ ΝΟΣΟ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ	ΝΤΜ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΑ ΣΠΑΝΙΑ ΜΕ ΝΟΣΟ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ
1.   ΒΡΑΔΕΩΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΑ
I.    ΜΗ ΦΩΤ0ΧΡΩΜΟΓΟΝΑ
M. avium-intracellulare	M. terrae complex
M. malmoense	M. shimodei
M. haemophilum.
M. ulcerans
II.        ΦΩΤΟΧΡΩΜΟΓΟΝΑ
M. kansasii.	M. simiae
M. marinum	M. asiaticum
	M. genavense
III.        ΣΚΟΤΟΧΡΩΜΟΓΟΝΑ
M. xenopi	M. gordonae
M. scrofulaceum	M. szulgai
2.   ΤΑΧΕΩΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΑ
M. fortuitum group		M. immunogenum
M. chelonae- M. ascessus		M. smegmatis

Το πόσιμο νερό έχει αποδειχτεί πως αποτελεί επίσης μια σημαντική πηγή διαβίωσης των περιβαλλοντικών μυκοβακτηριδίων. Τα είδη Μ. avium, M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M.kansasii, M. xenopi συναντώνται συχνότερα στο πόσιμο νερό και δημιουργούν επιδημίες και ψευδοεπιδημίες στην κοινότητα. Κάποια από τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά των ΝΤΜ, όπως η ικανότητα ανάπτυξής τους  σε χαμηλές θρεπτικές συγκεντρώσεις, η δημιουργία βιομεμβρανών, η αλληλεπίδρασή τους  με πρωτόζωα και η ανθεκτικότητά τους στην απολύμανση αποτελούν σημαντικούς παράγοντες επιβίωσής τους.

Δεν υπάρχουν στοιχεία μετάδοσής τους από ζώα σε άνθρωπο ή από άνθρωπο σε άνθρωπο.

Ασθένειες από NTM  έχουν παρατηρηθεί στις περισσότερες βιομηχανικές χώρες. Τα ποσοστά επίπτωσης κυμαίνονται από  1,0 έως 1,8 περιπτώσεις ανά 100.000 άτομα  έτσι όπως αυτά υπολογίζονται βάσει του αριθμού των απομονωθέντων NTM που έχουν αναφερθεί και συσχετισθεί με νόσο.

Με βάση τα δηλωθέντα στοιχεία από την αρχή της επιδημίας του AIDS στην Ελλάδα έως τις 31/10/2009 ΝΤΜ λοιμώξεις ανέπτυξαν 49 ασθενείς (≈1,5%) σε ένα σύνολο 2991, 36 (1,2%) ανέπτυξαν νόσο από M. avium ή M. kansasii και 13 ασθενείς (0,4%) ανέπτυξαν νόσο από άλλα ΝΤΜ.

Ως προς την παθογένεια των ΝΤΜ:

·         σε HIV αρνητικούς ασθενείς οι πνευμονικές λοιμώξεις από NTM έχουν συσχετισθεί με υφιστάμενες  νόσους των πνευμόνων όπως η χρόνια αναπνευστική   ανεπάρκεια και οι βρογχιεκτασίες, νόσους όπως η κυστική ίνωση  και με κάποιες ιδιαίτερες σωματικές καταστάσεις, κυρίως στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, όπως η συγγενής δυσμορφία του θωρακικού τοιχώματος (pectus excavatum), η σκολίωση και η πρόπτωση μιτροειδούς βαλβίδας  ενώ οι διάχυτες λοιμώξεις από ΝΤΜ έχουν συσχετισθεί με γενετικά σύνδρομα, που έχουν να κάνουν με συγκεκριμένες μεταλλάξεις στη σύνθεση και την ανοσιακή απάντηση της  ιντερφερόνης- γ (IFN-γ) και της ιντερλευκίνης-12 (IL -12).

Η IFN-γ και η IL-12 ελέγχουν τις μυκοβακτηριδιακές λοιμώξεις σε μεγάλο βαθμό μέσω της ρύθμισης του παράγοντα νέκρωσης των όγκων TNF-α, ο οποίος παράγεται κατά κύριο λόγο από τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα. Ο κρίσιμος ρόλος του TNF-α στον έλεγχο των ενδοκυττάριων λοιμώξεων έγινε σαφής μέσω της χρήσης των TNF-α αναστολέων. Έχει αποδειχθεί ότι πολύ ισχυρά ανασταλτικά αντισώματα έναντι του TNF-α όπως το infliximab και το adalimumab καθώς και ο διαλυτός υποδοχέας etanercept είναι αποτελεσματικοί αντιφλεγμονώδεις  παράγοντες και μπορούν να  οδηγήσουν σε σχετικά υψηλά ποσοστά ανάπτυξης ενεργούς μυκοβακτηριδιακής λοίμωξης σε εκείνους που έχουν τη λανθάνουσα μορφή της νόσου.  Έχουν αναφερθεί στο CDC 105 επιβεβαιωμένες περιπτώσεις ΝΤΜ λοιμώξεων που σχετίζονταν με αντι- TNF-α θεραπεία.

·         Σε HIV θετικούς ασθενείς οι γενικευμένες λοιμώξεις από ΝΤΜ συνήθως επέρχονται μόνο μετά την πτώση του αριθμού των CD4 + Τ-λεμφοκυττάρων κάτω από 50/μl, γεγονός που αποδεικνύει τον ιδιαίτερο ρόλο των T-cell κυττάρων στην αντίσταση κατά των μυκο-βακτηριδίων.

Οι κυριότερες κλινικές οντότητες που προκαλούν τα ΝΤΜ είναι:  πνευμονική λοίμωξη, λεμφαδενίτιδα, λοιμώξεις του δέρματος, των μαλακών μορίων και των οστών, γενικευμένη λοίμωξη ΝΤΜ και λοιμώξεις που σχετίζονται με διαδικασίες ή εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης.

Η NTM πνευμονοπάθεια  δεν έχει χαρακτηριστική κλινική εικόνα. Τα συμπτώματα είναι ποικίλα και γίνονται εντονότερα καθώς η λοίμωξη εξελίσσεται.  Όλοι οι ασθενείς έχουν χρόνιο ή περιοδικό βήχα. Επίσης μπορεί να έχουν κάποια ή όλα από τα παρακάτω συμπτώματα: παραγωγή πτυέλων, κόπωση, κακουχία, δύσπνοια, πυρετό, αιμόπτυση, πόνο στο στήθος και απώλεια βάρους. Η διάγνωση της λοίμωξης είναι συχνά δύσκολη καθώς τα συμπτώματα είναι παρόμοια με αυτά που προκαλούνται από συνυπάρχουσες παθήσεις των πνευμόνων, όπως η βρογχιεκτασία και η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια. Τα είδη που συχνότερα προκαλούν πνευμονική λοίμωξη είναι τα M. abscessus, M. avium complex, M. kansasii, M. malmoense & M. Xenopi.

Η NTM λεμφαδενίτιδα αποτελεί την πιο συχνή νόσο από ΝΤΜ σε παιδιά ηλικίας 1-5 ετών και συσχετίζεται με το γεγονός ότι στην ηλικία αυτή τα παιδιά έρχονται σε συχνή επαφή με περιβαλλοντικές πηγές ΝΤΜ όπως είναι το έδαφος και το νερό. Η πιο κοινή μορφή της νόσου είναι η τραχηλική λεμφαδενίτιδα. Ωστόσο μπορούν να προσβληθούν και άλλοι λεμφαδένες όπως οι υπογνάθιοι, οι προωτιαίοι και οι υπερκλείδιοι.  Ακόμα περιστασιακά μπορούν να προσβληθούν και άλλες ομάδες λεμφαδένων εκτός της περιοχής της κεφαλής και του τραχήλου όπως είναι οι μεσοπνευμόνιοι. Σε περίπτωση απουσίας HIV λοίμωξης η NTM λεμφαδενίτιδα σπάνια προσβάλει ενήλικες. Η  φυματιώδης λεμφαδενίτιδα σε αντίθεση με την ΝΤΜ λεμφαδενίτιδα εμφανίζεται σε πολύ μικρότερο ποσοστό στα παιδιά και σε πολύ μεγαλύτερο ποσοστό στους ενήλικες. Τα είδη που συχνότερα προκαλούν λεμφαδενίτιδα είναι τα M. avium complex, M. malmoense, M. scrofulaceum.

Τα είδη NTM τα οποία προκαλούν πιο συχνά λοιμώξεις του δέρματος, των μαλακών μορίων και των οστών είναι το Μ. fortuitum, το Μ. abscessus, το Μ. chelonae, το  Μ. marinum και το M. ulcerans, το οποίο προκαλεί το έλκος Buruli. Ωστόσο, σχεδόν όλα τα είδη NTM έχουν περιγραφεί ως αιτία δερματικής λοίμωξης. Τα ταχέως αναπτυσσόμενα είδη Μ. fortuitum, Μ. abscessus, Μ. chelonae μπορούν να προκαλέσουν το σχηματισμό τοπικού δοθιήνα ή αποστήματος σε σημεία πληγών που έχουν δημιουργηθεί από κάποιο αιχμηρό αντικείμενο, σε σημεία παρακεντήσεων, σε ανοικτά τραύματα ή σε περιοχές καταγμάτων.  

Οι γενικευμένες ΝΤΜ  λοίμωξεις  αποτελούν τις πιο συχνές και σοβαρές λοιμώξεις σε άτομα με προχωρημένη HIV λοίμωξη και εμφανίζουν παγκόσμια κατανομή. Παρά το γεγονός ότι μια σειρά από διαφορετικά είδη NTM έχουν αναφερθεί ως αιτία γενικευμένων ΝΤΜ λοιμώξεων, η συντριπτική πλειοψηφία (> 90%) αυτών των λοιμώξεων  προκαλούνται από MAC και ειδικότερα το M. avium. Ο μηχανισμός μόλυνσης των ατόμων με HIV δεν είναι απόλυτα γνωστός αλλά εικάζεται ότι γίνεται μέσω της κατάποσης των μυκοβακτηριδίων από κάποια περιβαλλοντική πηγή. Ασθενείς  των οποίων το αναπνευστικό και γαστρεντερικό σύστημα έχουν αποικισθεί από ΝΤΜ διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο να αναπτύξουν γενικευμένη ΝΤΜ λοίμωξη. Παραμένει προς το παρόν άγνωστο γιατί ορισμένα παθογόνα είδη NTM σπάνια προκαλούν γενικευμένη ΝΤΜ λοίμωξη. Για παράδειγμα, το M. abscessus  προκαλεί πνευμονοπάθεια με παρόμοια συχνότητα με το MAC αλλά δε σχετίζεται με διάχυτη λοίμωξη σε ασθενείς με AIDS. Ομοίως, το Μ. intracellulare είναι υπεύθυνο για τις περισσότερες MAC πνευμονοπάθειες στις Ηνωμένες Πολιτείες ενώ το M. avium είναι υπεύθυνο για τις περισσότερες γενικευμένες MAC λοιμώξεις σε ασθενείς με AIDS.

Οι περιπτώσεις ΝΤΜ  λοιμώξεων που σχετίζονται με διαδικασίες ή εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης, περιλαμβάνουν εκείνες  που συνδέονται με καρδιακές χειρουργικές επεμβάσεις, με ενέσεις, με πλαστικές χειρουργικές επεμβάσεις, με επεμβάσεις λιποαναρρόφησης, με επεμβάσεις κερατοειδούς, με διαδικασίες αιμοκάθαρσης, με τη μακροχρόνια εφαρμογή κεντρικών ενδοφλέβιων καθετήρων, με χειρουργικές επεμβάσεις μέσου ωτός και με μια ποικιλία από διάφορες άλλες χειρουργικές επεμβάσεις. Ο κοινός παρονομαστής σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις φαίνεται ότι είναι η έκθεση του ευπαθούς ατόμου σε κάποιο μολυσμένο από ΝΤΜ υγρό, το οποίο συνήθως είναι  το νερό της βρύσης. Κυρίως προκαλούνται από τα ταχέως αναπτυσσόμενα είδη.

Για τη χρώση των μυκοβακτηριδίων στα άμεσα ή έμμεσα παρασκευάσματα χρησιμοποιούνται  οι χρώσεις της φουξίνης:  Ziehl-Neelsen (Ζ-Ν) (θερμή μέθοδος) και Kinyoun (ψυχρή μέθοδος) κατά τις οποίες τα μυκοβακτηρίδια χρωματίζονται κόκκινα ενώ τα άλλα βακτήρια και τα κύτταρα (π.χ. επιθηλιακά) μπλε.&  οι χρώσεις με φθορίζουσες χρωστικές: μέθοδος Auramine- O και Auramine- Rho-damine κατά τις οποίες τα μυκοβακτηρίδια εμφανίζονται κίτρινα, λαμπερά σε μαύρο ή κόκκινο φόντο ανάλογα με το μεταχρωματιστικό διάλυμα που θα χρησιμοποιηθεί.

Για την ανάπτυξη των μυκοβακτηριδίων χρησιμοποιούνται στερεά, υγρά και διφασικά υλικά.

Τα κυρίως χρησιμοποιούμενα στερεά θρεπτικά υλικά είναι το Lowenstein- Jensein (L- J), το Middlebrook 7H10 άγαρ και το Middlebrook  7H11  άγαρ. Το  Lowenstein-Jensen (L-J) αποτελεί  το υλικό εκλογής και είναι απαραίτητο έστω και αν χρησιμοποιηθεί και άλλο θρεπτικό υλικό.

 Εκτός από το το Middlebrook  7H9, το οποίο χρησιμοποιείται κυρίως στις δοκιμασίες ταυτοποιήσης κυκλοφορούν διάφορα υγρά θρεπτικά υλικά σε αυτοματοποιημένα συστήματα καλλιεργειών όπως το Bactec 9000 MB, το Bactec MGIT 960, το Bac T/ALERT.

Η ταυτοποίηση των μυκοβακτηριδιακών ειδών γίνεται βάσει των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών τους (μικροσκοπικοί και καλλιεργητικοί χαρακτήρες), των βιοχημικών ιδιοτήτων τους, της χρωματογραφικής ανάλυσης των λιπιδίων του τοιχώματός τους που είναι διαφορετικά για κάθε είδος (υγρή χρωματογραφία, HPLC (High Performance Liquid Chromatography))  και με μεθόδους μοριακής βιολογίας.

Το ΕΚΑΜ για την ταυτοποίηση των ΝΤΜ που αναπτύσσονται στις καλλιέργειες των δειγμάτων που δέχεται από το Π.Γ.Ν.Ν.Θ «Η ΣΩΤΗΡΙΑ» αλλά και νοσοκομεία από όλη την Ελλάδα χρησιμοποιεί μέθοδο της μοριακής βιολογίας και συγκεκριμένα  PCR & ανάστροφο υβριδισμό με την τεχνική της εταιρείας Hain Lifescience GenoType Mycobacterium CM (Common Species) για τα είδη που συναντώνται συχνότερα &  GenoType Mycobacterium AS (Additional Species) για τα είδη που συναντώνται σπανιότερα.

Στην τεχνική αυτή συγκεκριμένα για κάθε είδος probes είναι ακινητοποιημένα με ορισμένη σειρά πάνω σε ταινίες νιτροκυτταρίνης (strips). Μετά τον πολλαπλασιασμό με PCR του μυκοβακτηριδιακού DNA χρησιμοποιώντας βιοτινιλισμένους εκκινητές (viotinylated primers)  ειδικούς του γένους, γίνεται υβριδισμός και όπου υπάρχει συμπληρωματική ακολουθία, δημιουργούνται υβρίδια στις αντίστοιχες των probes θέσεις. Ακολουθεί προσθήκη στρεπταβιδίνης σημασμένη με αλκαλική φωσφατάση, η οποία συνδέεται όπου υπάρχει υβρίδιο-βιοτίνη.

Επώαση με το υπόστρωμα BCIP/NBT δίνει χρωμογόνο αποτέλεσμα μωβ/καφέ με τη μορφή ζώνης, η θέση της οποίας πάνω στην ταινία (strip) υποδηλώνει το είδος του μυκοβακτηριδίου. (Μαρίνης και συν.,2006).

Η μέθοδος έχει διαπιστευθεί από το Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης (ΕΣΥΔ) και περιλαμβάνεται στο Πεδίο Διαπίστευσης του Εργαστηρίου με αρ. πιστοποιητικού 913. 

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1.       Αρσένη Αντιγόνη,  «Κλινική και Εργαστηριακή Διάγνωση Λοιμώξεων» (Τόμος 1&2), Ζήτα, 1994, Αθήνα.

2.       ΚΕ.ΕΛ.Π.ΝΟ., Υπουργείο Υγείας & Κοινωνικής Αλληλεγγύης, Δελτίο Επιδημιολογικής Επιτήρησης της HIV/AIDS λοίμωξης στην Ελλάδα, Οκτώβριος 2009,τεύχος 24, σελίδα 32.

3.       Μαρίνης Ε, Βογιατζάκης Ε.Δ, Βρυώνη Γ «Εργαστηριακή Μυκοβακτηριδιολογία», Έκδοση Μαρίνης Ε, Βογιατζάκης Ε.Δ, Βρυώνη Γ, Αθήνα, 2006, ISBN: 960-6656-06-3 .

4.       Παπαβασιλείου Ιωάννης, Bienz kurt, Eckert Jonannes. «Ιατρική μικροβιολογία: ανοσολογία, βακτηριδιολογία, μυκητολογία, ιολογία, παρασιτολογία» Εκδόσεις, Μαρία Γρ. Παρισιάνου, Αθήνα 1995.

5.       David E. Griffith, Timothy Aksamit, Barbara A. Brown-Elliott, Antonino Catanzaro, Charles Daley, Fred Gordin, Steven M. Holland, Robert Horsburgh, Gwen Huitt, Michael F. Iademarco, Michael Iseman, Kenneth Olivier, Stephen Ruoss, C. Fordham von Reyn, Richard J. Wallace, Jr., Kevin Winthrop on behalf of the ATS Mycobacterial Diseases Subcommittee. An Official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 175. pp. 367-416, (2007), © 2007 American Thoracic Society, doi: 10.1164/rccm.200604-571^ST

6.       Dorman SE, Holland SM. Interferon-gamma and interleukin-12 pathway defects and human disease. Cytokine Growth Factor Rev 2000;11:321.

7.       Falkinham III, J.O., Norton, C.D .  and LeChevallier, M.W., (2001). Factors influencing numbers of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare and other mycobacteria in drinking water distribution systems. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1225-1231

8.       Iseman MD, Buschman DL, Ackerson LM. Pectus excavatum and scoliosis: thoracic anomalies associated with pulmonary disease caused by Mycobacterium avium complex. Am Rev Respir Dis 1991;144:914).

9.       Kevin L. Winthrop, Eric Chang, Shellie Yamashita, Michael F. Iademarco, and Philip A. LoBue, Nontuberculous Mycobacteria Infections and Anti–Tumor Necrosis Factor-α Therapy, Author affiliations: Oregon Health and Sciences University, Portland, Oregon, USA (K.L. Winthrop, E. Chang, S. Yamashita); US Public Health Service, Washington, DC, USA (M.F. Iademarco); and Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA (P.A. LoBue), Vol. 15, No. 10 • October 2009.

10.    Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology”, Washington Winn, Jr., Stephen Allen, William Janda, Elmer Koneman, Gary Procop, Paul Scheckenberger, Gail Woods, 6^th edition, 2006, Lippincott Williams & Wilkins, USA, 978-0-7817-3014-3.

11.    Mario J.M. Vaerewijck, Ge ert Huys, Juan Carlos Palomino, Jean Swings, Francoise Portaels, (2005). Mycobacteria in drinking water distribution systems: ecology and significance for human health. FEMS Microbiology Reviews 29 911-934

12.    Olivier KN, Weber DJ, Wallace RJ Jr, Faiz AR, Lee JH, Zhang Y, Brown-Elliot BA, Handler A, Wilson RW, Schechter MS, et al.; Nontuberculous Mycobacteria in Cystic Fibrosis Study Group. Nontuberculous mycobacteria. I: multicenter prevalence study in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2003;167:828–834

13.    Tortoli E. Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria of the 1990's. Clin Microbiol Rev 2003;2:319–354

14.    United States Enviromental Protection Agency ( US EPA,2002). Health risks from microbial growth and biofilms in drinking water distribution systems, June 17, 2002, 50 pp.